用于测试抗静脉畸形候选药物的人类细胞3D体外模型

引言

静脉畸形（VMs）是常见的先天性血管畸形之一。标准治疗方法是手术和/或硬化治疗，但由于病变的大小或位置，手术切除可能无法进行，并且畸形组织往往会再生，迫切需要开发医疗疗法。作为该领域的突破，近期的研究表明，大多数VMs是由内皮细胞（ECs）中TIE2-PIK信号通路的体细胞获得性功能突变引起的。针对VMs的分子药物西罗莫司（也称为雷帕霉素）可以通过抑制mTORC2在体外减少Akt的完全作用，并且在临床试验中西罗莫司可以减少VM病变[1,2] 。

然而，西罗莫司有一定的局限性；在体外，它不能使所有的分子/细胞VM异常正常化，在人体中它具有有效的免疫抑制作用。此外，TIE2/PIK3CA突变阴性的VMs可能是由不直接与Akt信号通路相关的基因突变引起的[3,4] 。

因此，目前的临床治疗很少具有治愈性，没有临床药物针对突变的TIE2或PIK。因此，研究新的分子药物对于开发有效的个性化VM靶向医疗疗法是必要的。在这里，研究者使用人脂肪基质细胞（hASC）/脐静脉内皮细胞（HUVECs）在纤维蛋白凝胶中的3D共培养开发了VM体外模型。研究者发现这个模型适合研究由致病性TIE2突变引起的细胞异常（间充质细胞分化、管形成、ECM沉积）并测试候选药物的效力以正常化细胞异常。

研究者研究了雷帕霉素（作为黄金标准）、阿培利司（PI3K抑制剂）、AZ03（由阿斯利康开发的TIE2抑制剂）的效果。流动对VM内皮细胞的影响也在由Finnadvance设计和制造的微流体装置中的hASC/HUVEC共培养系统中进行了测试。

材料与方法

在共培养模型中（下图），首先在培养板上涂覆纤维蛋白凝胶，然后加载hASCs（20,000个细胞/平方厘米），数小时后在其上加载HUVECs（5,000个细胞/平方厘米）。使用由FICAM（VA Cure合作组织）开发的特定血管刺激培养基来增强内皮细胞管形成。第5天加入不同药物以评估其对增大的内皮细胞管、ECM沉积和SMCs覆盖的影响。共培养模型在这种培养基中培养7天，然后用共聚焦显微镜固定和成像。

为了检查共培养模型中流动对管形成的影响，微流体通道用纤连蛋白（100 µg/mL）涂覆，然后分别在数小时内加载hASCs（2×10⁴个细胞/mL）和HUVECs（2×10⁴个细胞/mL）。芯片分别在静态模式和放置在摇床上的动态模式下进行培养。AKTIA 精密摇摆系统调整为25°角和 2 RPM以施加0.4-4.0 Pa的剪切应力。

图：AKITAPlate96-Blood VesselMacro & micro-vasculature

结果

1. 逆转录病毒转导HUVECs的蛋白质印迹分析

使用逆转录病毒基因转移在HUVECs中表达引起VM的TIE2-L914F突变，TIE2-WT和不表达TIE2的HUVECs用作对照。细胞使用双顺反子IRES载体转导，因此转导的细胞也表达GFP标记基因（IG）。图1显示HUVECs IG与正常HUVECs相似，WT和突变体中TIE2的表达水平相似，研究者的目标是WT和突变体之间的差异在于突变体中的TIE2磷酸化。

图1. (A) 显示了免疫沉淀中的TIE2表达和磷酸化水平，(B, C) 显示了蛋白质印迹中TIE2和Akt的水平以及抗肌动蛋白。右侧显示了蛋白质印迹信号的定量结果。

2. 正常、TIE2WT和TIE2L914FHUVECs的形态及治疗（阿培利司、雷帕霉素和Az03）对人脂肪干细胞/内皮细胞共培养模型中血管结构的影响，内皮细胞用CD31染色，aSMC表示hASCs向平滑肌样细胞的分化，ECM用ColIV染色。（图2）。

图2：A & A1, B & B1）正常和TIE2WT HUVECs形成了管状网络，如其他人以前所示。C & C1) TIE2L914F结果表现为异常增大的血管结构，Col IV分散，SMCs覆盖较少。D & D1, E & E1, F & F1）显示TIE2^L914F血管结构在处理Az03 1µM、阿培利司1µM和雷帕霉素100nM 48小时后的变化。

3. 在微流体通道中加载胶原蛋白1型（1mg/mL）的hASCs和HUVECs混合物的管状形成（图3）。

图3. A, B和C）分别显示了hASCs与正常、TIE2WT和TIE2L914F HUVECs共培养的管状形成。D, E）分别显示了静态和动态模式下的COL IV沉积。F）显示了流动对静态和动态模式下管状结构取向的影响。

4. 血管和SMCs直径及体积的定量分析

图4意味着血管相对的SMCs覆盖率在TIE2L914F中更低，并且在TIE2L914F中通过阿培利司和AZ03 TIE2抑制剂得到了抑制。

图4：A) 管道（COL IV）直径测量显示，经过阿培利司和AZ03治疗后，异常增大的血管数量减少。B) 使用Imaris进行3D渲染，测量每个血管和SMCs，并绘制SMCs体积与血管体积的比例。

结论

在本研究中，研究者开发了一个使用hASCs和引起静脉畸形的逆转录病毒转导HUVECs的3D体外共培养模型。

该3D模型在三个主要方面模拟了静脉畸形，包括增大的血管、异常组织的血管周围ECM和较低的SMC覆盖率[5] 。更有趣的是，该模型对TIE2抑制剂有反应，并显示出用于进一步药物筛选的高潜力。此外，使用微流体芯片并引入流动，研究者研究了流动对该体外疾病模型中ECM沉积取向的影响。

参考文献

[1]Queisser, Angela, et al. "Genetic basis and therapies for vascular anomalies." Circulation Research 129.1 (2021): 155-173.

[2]Harbers, Veroniek EM, et al. "Patients with Congenital Low-Flow Vascular Malformation Treated with Low Dose Sirolimus." Advances in Therapy 38.6 (2021): 3465-3482.

[3]Castel P, et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Sci Transl Med 2016;8:332ra42.

[4]Huttala, Outi, et al. "Human vascular model with defined stimulation medium-a characterization study."(2015).

[5]Boscolo, Elisa, et al. "Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects." The Journal of clinical investigation 125.9 (2015): 3491-3504.

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