一、简介

Akura 96/384孔微球培养板是一种经过精心设计和工程改造的超低吸附培养板，可以用于无支架3D细胞模型的构建和测试。培养板具有独特的深孔构造，其特殊的SureXchange换液平台可以简便地实现更为温和和彻底的培养基交换。Akura系列培养板中产生的细胞微球大小均匀，适用于开展高通量、高重复、高可靠性的测试实验，并能广泛兼容多种终点分析和生化分析以及大多数高分辨率的细胞成像应用。

以下实验方案描述了使用Akura系列培养板生成3D肿瘤微球的实验方法，旨在为成功开展实验提供详细的指导，并提高首次使用产品的体验。本方案包括了培养板的准备、单细胞悬液的制备、细胞铺板密度的优化、细胞快速和均匀聚集的技巧以及建议的质量控制步骤。

二、HCT-116和HEY的3D细胞模型构建（Akura 96孔微球培养板，图1）

图1：Akura 96孔超低吸附微球培养板（InSphero，CS-09-004-03）

1、实验材料

•  冻存的HCT-116细胞（人结肠癌细胞系：ATCC，CCL-247）和HEY细胞（人卵巢癌细胞系：ATCC，CRL-3252），1 x 10⁶细胞/管

•  适宜的细胞培养基

•  T75细胞培养瓶（Greiner，658175）

•  Akura 96孔微球培养板（InSphero，CS-09-004-03）

•  无菌PBS缓冲液（无钙镁离子）（Sigma-Aldrich，D1408）

•  胰酶

•  70%乙醇

•  血球计数板

•  水浴锅（设置在37℃）

•  血清移液管（5ml和10ml）

•  离心机

•  一级生物安全柜

•  二氧化碳培养箱（设置在5% CO₂浓度和37℃）

•  倒置显微镜

•  15ml无菌离心管

•  多通道移液器、适配的无菌吸头、无菌试剂槽

•  可选项：自动化明场细胞微球成像仪（SCREEN Cell3iMager）

2、HCT-116和HEY细胞的扩增

注意：所有实验步骤遵照无菌操作规范在生物安全柜中操作。

1. 确保所有细胞培养基标记清晰并在正确的条件下存放。

2. 将培养基预热至37℃。

3. 向T75中加入5ml预热的培养基。

4. 在水浴锅中快速融化细胞。

5. 使用血清移液管吸取5ml预热的培养基，并于融化的细胞混合，将混匀液转移至15ml离心管中。

6. 室温下离心，200 RCF 2min，弃去上清液，并用5ml预热培养基重悬细胞。

7. 将细胞转移至T75中。

8. 将T75转移至二氧化碳培养箱中。

9. 培养24h后，更换培养基，并在显微镜下检查细胞贴附情况。

10.当细胞达到70-80%交汇度时（约48h）可以用于下游的细胞微球培养。

3、制备单细胞悬液

1. 将培养基预热至37℃。

2. 将T75从二氧化碳培养箱中取出，使用血清移液管弃去培养基。

3. 向T75中加入10ml的PBS。

4. 轻轻摇晃培养瓶后弃去PBS。

5. 加入1ml的胰酶（1x），于37℃孵育5min。

6. 加入9ml的完全培养基（含FBS）终止消化。

7. 将细胞液转移至15ml离心管。

8. 室温下离心，200 RCF 2min，弃去上清液，并用适量（取决于细胞压积）预热培养基重悬细胞。

9. 使用血球计数器（或其他细胞技术方法）进行计数。

10.调整细胞密度至1.43 x 10⁵细胞/ml（即10000细胞/70μl）及其他浓度（即2500细胞/70μl，500细胞/70μl，100细胞/70μl）。

4、3D细胞模型的构建-铺板（图2）

图2：Akura 96孔微球培养板的使用流程

1. 使用70%乙醇擦拭Akura培养板的外包装，并在生物安全柜中取出Akura培养板。

2. 将单细胞悬液转移至试剂槽中，使用移液器轻轻吹打细胞悬液以保证浓度均一。

3. 使用多通道移液器或自动化工作站将细胞种植至Akura培养板，每孔70μl。

4. 盖上板盖，室温下离心，250 RCF 2min。

5. 将培养板转移至湿润的二氧化碳培养箱中，并保持斜立（与水平面夹角30度，图3）。此过程可以使用InSphero专门设计的Akura斜立支架（InSphero，CS-10-002-00）或将培养板的一侧垫高。

图3：Akura斜立支架（InSphero，CS-10-002-00）

6. 3D细胞模型的大小和活力检测可以使用明场成像系统（如SCREEN Cell3iMager）以及活力检测试剂盒（Promega Celltiter-Glo Assay）。

5、结果

图片展示了成熟3D细胞模型的代表性结果，包括取决于铺板密度的细胞微球尺寸和两种细胞的模型比较（图4-5），以及培养板孔间细胞微球尺寸的均一性（图6）。

图4：不同细胞类型使用不同数量细胞进行铺板并培养3天时细胞微球的明场成像

图5：不同细胞类型使用不同数量细胞进行铺板并培养3天时细胞微球直径分布（6个重复）

图6：HCT-116细胞培养3天后肿瘤微球的直径均一性，A为明场图片，B为直径分布热图

6、结论

Akura 96孔微球培养板是为3D细胞模型的常规生成和长期培养而设计的。惰性超低吸附表面确保细胞微球在生长过程中不会粘附在板内。独特的SureXchange换液平台可实现大于90%的培养基更换，同时保护细胞微球避免其被意外吸去或损坏。培养板的环烯烃聚合物（COP）材质可以与大多数溶剂兼容，因此可以在培养板中直接进行多种终点分析和生化分析。培养板的尺寸符合ANSI/SLA标准，确保了其可以很好地兼容自动化系统和常规实验环节。平坦透明的底部可在各种显微镜和高内涵成像平台上实现真实、非扭曲的亮场和荧光成像。

三、NCI-N87-GFP和NIH-3T3-RFP共培养的3D细胞模型构建（Akura384孔微球培养板，图7）

图7：Akura 384孔超低吸附微球培养板（InSphero，CS-09-003-02）

1、实验材料

•  Akura 384孔微球培养板（InSphero，CS-09-003-02）

•  荧光显微镜或高内涵细胞成像仪（Leica DMi8或Yokogawa CQ1）

•  其他项目参见“第二部分-实验材料”

2、NCI-N87-GFP和NIH-3T3-RFP细胞的扩增

实验步骤同上，参照“第二部分- HCT-116和HEY细胞的扩增”。

3、培养板的准备-预湿润

注意事项：

•  在使用前对Akura 384孔微球培养板进行预湿润操作，可以有效避免孔内气泡的产生

•  Akura 384孔微球培养板的底部是25μm厚的气透膜，在实验操作时请注意移液器吸头不要接触底部的气透膜以免造成损坏

•  Akura 384孔微球培养板的孔内结构是非轴对称的，其换液平台在靠近孔上侧的位置（A行），其容纳细胞的深孔在靠近孔下侧的位置（P行）（图8）

图8：Akura 384孔微球培养板孔内设计

•  所有实验步骤遵照无菌操作规范在生物安全柜中操作

1. 向每孔加入50μl PBS溶液。请让吸头尖端尽量靠近但是不要触碰孔底。此过程建议使用多通道移液器完成。

2. 室温下离心，250 RCF 2min。

3. 将培养板转移至湿润的二氧化碳培养箱，并孵育1天以上。

4. 在开展培养实验前，将培养板从二氧化碳培养箱中取出。

5. 室温下离心，250 RCF 2min，并弃去PBS。

4、制备单细胞悬液

1. 除额外说明的步骤，其余步骤与“第二部分-制备单细胞悬液”相同。

2. 细胞密度调整：调整细胞密度至500细胞/50μl至3000细胞/50μl（依据铺板密度）。

5、3D细胞模型的构建-铺板（图9）

图9：Akura 384孔微球培养板的使用流程

1. 除额外说明的步骤，其余步骤与“第二部分-制备单细胞悬液”相同。

2. 使用多通道移液器或自动化工作站将细胞种植至Akura培养板，每孔50μl。

3. 3D细胞模型的大小和活力检测可以使用明场成像系统（如SCREEN Cell3iMager）、荧光显微镜（Leica DMi8或Yokogawa CQ1）以及活力检测试剂盒（Promega Celltiter-Glo Assay）。

6、结果

肿瘤细胞和成纤维细胞可以在Akura 384孔微球培养板中通过无支架、重力辅助的方法生成尺寸均匀的致密细胞微球（图10），是高通量筛选的先决条件，并可以很好地兼容自动化液体工作站以及自动化高内涵细胞成像系统，因此符合基于成像的筛查实验的需求。

图10：NCI-N87-GFP和NIH-3T3-RFP细胞共培养时细胞微球的荧光成像

7、结论

Akura 384孔微球培养板是为3D细胞模型的常规生成和长期培养而设计的。惰性超低吸附表面确保细胞微球在生长过程中不会粘附在板内。独特的SureXchange换液平台可实现大于90%的培养基更换，同时保护细胞微球避免其被意外吸去或损坏。培养板的材质可以与大多数溶剂兼容，因此可以在培养板中直接进行多种终点分析和生化分析。培养板的尺寸符合ANSI/SLA标准，确保了其可以很好地兼容自动化系统和常规实验环节。平坦透明的底部可在各种显微镜和高内涵成像平台上实现真实、非扭曲的亮场和荧光成像。