前言

含干细胞丰富的脐血已经在全球范围内被用于进行脐血干细胞移植治疗白血病、免疫和遗传性等数万种疾病。鉴于脐血的宝贵，脐血的保存对于无论是满足个人需求还是社会需求都比较重要和必要。自1992年第一个脐带血库项目启动以来，脐血干细胞低温冻存方法和流程一直保持相对不变。  一般来说，在脐带血单位(CBU)的红细胞耗尽后，浓缩的白细胞部分通过逐渐加入含DMSO溶液冷冻保存，从而获得的最终脐血样本（该体系中DMSO终浓度为10%体积比）。上述冻存方法中的DMSO冻存溶液通常含有渗透稳定剂和血清，如Dextran右旋糖酐和HSA人血清白蛋白。主要操作过程大致为：准备浓缩的低温冻存液(2X或5X)，然后缓慢(15分钟以内)逐步添加浓缩溶液到CBU。  这种缓慢、渐进式的添加冻存液的方法可用于保护细胞免受高DMSO浓度造成的破坏性渗透压力，以及当浓缩DMSO溶液与细胞溶液混合时发生的高放热反应。

然而从业人员也在从以下考虑角度寻求新的脐血保存的方法：

• 减少脐血制备和处理时间

• 改善解冻后的细胞活力和恢复/复苏率

• 减少毒性DMSO使用浓度

• 消除血清和蛋白质的依赖

本文研究者主要目的是评估添加传统标准冻存液的速率对CBU相关性能复苏回收率（recovery）的影响，并将结果与美国Biolife品牌预先配制/即用型、无血清和无蛋白、渗透平衡的冻存液CryoStor冷冻CBU的结果进行比较。结果表明，快速加入浓缩的传统低温冻存溶液降低了解冻后的总体复苏率。而快速加入CryoStor的复苏率相当于甚至优于缓慢加入传统标准冷冻保存液。

一、实验方法

• 脐血的采集和处理

根据普吉特湾血液中心(PSBC)的标准程序，在患者同意后获得的CBU指定用于研究目的。取下0.5 ml样本进行人工TNC（Total Nucleated Cell）计数和细胞活力评估。富含白细胞的上清液被转入到600ml的转移袋(Baxter)中，离心后获得白细胞富集液最终体积为25.5 ml(最终产品)。取下0.5ml溶液进行预冷冻分析。剩余的分成两份12.5毫升待分析样本至不同的转移袋中并放在冰上。

• 冻存

向一组样本中添加12.5ml 标准冻存溶液(20%右旋糖酐，20% DMSO, 48%羟乙基纤维素,12% ACD-A，使用当天制备)，另外一组样本中加入同等体积12.5ml的 CryoStor CS10 (Biolife Solutions)，CS10样本组中DMSO初始浓度为10%和最后DMSO终浓度为5%。为了评估冻存液添加速度的影响，使用每分钟1毫升的手动添加速率评估了10个再分装小样，另外6个分装样品使用快速注入低温冻存液进行了评估。加入冷冻保存液后，立即将细胞-冻存液混合物转移到25ml冷冻袋中，然后进行程序降温仪的标准控制速率冷冻后长期超低温冻存。

• 测试

CBU样本解冻后进行TNC、CD34和CFU等测定，并与样本冷冻前的测试数据进行比较。细胞存活率用吖啶橙/Pl溶液按1:1稀释，显微镜下计数细胞来统计。对于代表脐血造血干细胞的增殖和分化能力的CFU则用Methocult培养基的kit以30 × 103/ml细胞种板密度接种在35mm培养皿中，并在培养10-14天后计数菌落，FACS流式细胞术进行CD34+细胞分析。

二、实验结果

1、脐带血冷冻冻存过程中比较PSBC标准CPA冻存液慢速添加与快速的性能差异

在两种快慢速添加PSBC标准CPA冻存液的两组条件下，对存活的TNC、存活的CD34+、脐血红系爆式集落BFU、CFU和总菌落复苏回收率进行解冻后分析。与缓慢添加标准的CPA相比，快速添加PSBC超低温保存溶液会显著降低测试的每个参数。

2、脐血冷冻冻存过程中比较慢速添加PSBC标准CPA与快速添加CS10性能差异

在慢速添加PSBC标准的CPA冻存液和快速添加Biolife冻存液CS10两组条件下，对存活的TNC、存活的CD34+、BFU、CFU和总菌落复苏回收率进行解冻后分析。快速添加CS10与缓慢添加PSBC冻存液液的大部分测试参数中较优或相当，且获得的最终脐血细胞样本中DMSO浓度只有一半(5%v/ v)。

3、脐带血冷冻冻存过程中比较慢速添加PSBC标准CPA冻存液和CS10冻存液性能差异

在慢速添加PSBC标准的CPA冻存液和慢速添加Biolife冻存液CS10两组条件下，对存活的TNC、存活的CD34+、BFU、CFU和总菌落复苏回收率进行解冻后分析，缓慢添加CS10冻存液组评估的每个解冻后参数的复苏回收率都比PSBC组高。

三、实验结论

1、与较慢的冻存液添加速度相比，快速添加传统的超低温保存溶液(以PSBC为例)会降低CBU的整体解冻后细胞恢复性能

2、与缓慢加入相比，快速加入PSBC标准冻存液溶液导致

• 25%的可存活TNC损失

• CD34+细胞和CFU均有减少趋势

3、快速添加CryoStor CS10（最终DMSO浓度的一半）与缓慢添加PSBC溶液相比，获得了类似的活性TNC、CD34+细胞含量和菌落计数

4、与添加PSBC的不同速度相比，缓慢添加Biolife品牌的CryoStor CS10带来：

• 增加了25%的CD34+细胞的复苏回收率

• 改善BFU, CFU和总菌落计数

5、美国Biolife品牌CryoStor CS10提供了在不损害当前相关脐血细胞复苏活率和恢复标准的情况下快速添加入脐血干细胞产品的可能性；

Biolife-CryoStor冻存液

• 提供细胞冻存时细胞的渗透平衡保护，改善了干细胞、免疫细胞如T细胞等多种细胞解冻后的复苏性能；

• 预配置即用型冻存液；

• 无血清和不含蛋白质成分；

• 减少产品中DMSO终浓度；

• FDA备案DMF，全球IND案例几百项（辅料和辅助材料等应用）。

上海曼博生物医药科技有限公司系BioLife Solutions中国区官方授权一级代理商，为国内客户提供包括Biolife明星产品CS10 (210102)等无血清、无蛋白成分原装品牌直接进口的多种系列冻存液产品，如有相关产品技术和销售咨询请联系上海曼博生物。