生物制药占全球药品销售额的很大一部分，2019年全球十大药物重磅炸弹中有八个是重组生物制药。为确保高水平的临床试验期间的患者安全和药品放行，不同的监管机构制定了许多法规，例如FDA和EMA。药品的市场准入上市申请需要对潜在风险和收益、关键质量属性 (CQA) 进行深入的全面评估，这些属性包含在通用技术文件 (CTD) 中。其中，宿主细胞蛋白 (HCP) 就是这样一种 CQA。它们形成具有不同理化和免疫特性的蛋白质的复杂混合物，并且是在生物制品制造过程中由生产细胞系释放。

复杂细胞生产系统的 HCP 形成受多种生物和非生物因素的影响，很难预测单个制造过程的 HCP 表现模式。因此 HCP 被定义为与工艺相关的药物杂质，会对生物药物产品的质量、安全性和功效产生负面影响，对患者具有潜在风险，因为它们可能在人体内表现出免疫原性或其他不希望的活性。在纯化过程中，必须有效降低HCPs，以确保去除最终原料药中不需要的HCP蛋白质。

EMA 和 FDA 这两个主要监管机构发布了一套指导方针，以监管生产过程中对 HCP 的控制。这些指南的要点是：

•  建议采用高度敏感的方法

•  需要定期检测残留 HCP 

•  要求最终原料药中 HCP 残留允许量为 (<1-100 ppm)

特别是 ICH 指南 Q6B、Q8(R2)、和 Q11 定义了此类杂质，并明确了在逐步下游加工过程 (DSP) 中精确监测和减少 HCP 的需求，一直到很低的含量。尽管没有指定精确值，但普遍的共识是将最终原料药中的 HCP 负担降低到100 ppm 以下和 10 ng/剂以下。

准确检测后续 DSP 样品直至最终原料药中的 HCP 杂质在很大程度上取决于建立可靠且稳健的 HCP 测量方法。为了克服对于 HCP 定量的个别方法的内在局限性，建议使用多方面的 HCP 分析方法。目前，有一系列方法可用于监测药物生产过程中HCP的下降。但因酶联免疫吸附试验 (ELISA) 方法具有高速、高灵敏度和高通量相结合的优点，且无需高成本的仪器，因此仍然被认为是 HCP 检测的金标准。

对 HCP 监控的需求和 HCP ELISA 的选择思考

监管机构已就使用不同的宿主细胞蛋白酶联免疫吸附测定 (HCP ELISA) 形式检测 HCP提出了一致的建议。根据生物制品的开发阶段，用于 HCP 定量的 HCP ELISA 可分为三种主要形式（如下图）：

1）通用型 HCP ELISA 试剂盒，也即商业化的 HCP 试剂盒；

2）工艺平台（或多产品）型 HCP ELISA，也即根据具体工艺流程/平台定制的 ELISA方法和配套的试剂；

3）工艺特定型 HCP ELISA，以及单独为某一种药物特定的工艺开发的 ELISA 方法和配套的试剂。

用于 HCP 定量的三种 ELISA 方法

HCP ELISA 的适用性通常由性能标准决定，例如：即使在高度纯化的样品中也能检测 HCP 痕量的检测方法的灵敏度，以证明下游工艺过程 (DSP) 中的 HCP 对数降低、严格的稀释线性和足够的 HCP 抗原特异性抗体覆盖率。虽然商业化的通用型 HCP ELISA 使用广泛活性的抗体覆盖方法，但该方法仅针对重组蛋白生产的选定细胞系种类，后两种 HCP ELISA 形式基于对特定生物制药的制造和加工提供更高的特异性。

对于在候选药物开发的不同阶段最好使用哪种 HCP ELISA 方法，这并无法给出一个很明确的答案。如图所示，在临床试验的 I 期和 II 期期间仍可能发生 DSP 开发的变化。后者的完成（II期）则需要为高度稳健性的工艺定义工艺参数规范。相比之下，用于临床 III 期试验的原料药必须满足与上市后连续生产药物相同的要求。对于这一阶段（III期）的药物生产，所有过程都需要进行验证，包括分析方法的使用。如果在此阶段（III期）对生产过程进行更改，则必须重复工艺验证，直到达到足够的一致性。这包括监测残留的 HCP 杂质，当在生产或 DSP 过程中引入变化时，这些杂质的数量和成分在技术上会有所不同。

因此，最常见的建议是在方法开发过程中仅依赖广泛有效的通用型 HCP ELISA 试剂盒（II期前）。在向 II 期和 III 期扩展临床试验申请前进时，工艺特定的 HCP ELISA 的实施通常证明足以用于 HCP 监测，从而满足测定验证的标准。在生产和 DSP 条件以及不同生物制品药物的主要性质差异很小，没有对相应的 HCP 表现模式产生很大影响的情况下，使用平台（多产品）型 HCP ELISA 就足够了。

不同阶段使用的不同HCP检测策略

综上所述，平台型或工艺特定的 HCP 检测让您高枕无忧。然而，由于药物失败的高风险，此类检测仅在开发的后期阶段才值得投资。本篇接下来将重点介绍商业化通用型CHO HCP ELISA试剂盒，近期将另撰写文章介绍定制化的平台型或工艺特异型的 HCP ELISA 开发策略。

如何选择最合适的HCP ELISA检测试剂盒？

从理论上讲，通用型HCP ELISA试剂盒应适用于特定细胞系的所有HCP测定，不受细胞系改造、发酵条件和纯化工艺设计的影响。但在大多数情况下，根据细胞系、培养基和工艺参数的不同，HCP的污染物可能会有很大差异。 HCP 试剂盒对所有 HCP 的识别程度将取决于其配套的抗体与实际 样本中HCP 组成的匹配程度，以及针对不同HCP的抗体丰度和对相应的 HCP 的亲和力。因此，各种商业化通用型 HCP ELISA 在检测相似类型和水平的 HCPs 的能力方面可能存在很大差异。并非所有的商业化通用型HCP ELISA试剂盒能在每个项目中均显示出所需的特异性和敏感性。

解决方案--增强的通用型HCP ELISA试剂盒组合套装

德国有名的生物技术公司 BioGenes 已经开发出一种增强的通用 CHO 360-HCP 分析方法，明显优于当前的其他商业化通用型 HCP ELISA 试剂盒。

自1999年以来，BioGenes 已开发出多种 HCP ELISA 试剂盒和方法，包括通用型，平台型和工艺特异型。在使用不同细胞系完成了150多个项目后，BioGenes 已在 HCP 残留检测领域打下了深厚的基础，积累了宝贵的定制开发与协助申报的能力。在经验丰富的科学家和积极主动的项目管理团队的支持下，BioGenes 具备提供多方位服务的能力，受到全球客户的赞赏。

Biogenes 目前的通用型 HCP ELISA 产品主要包括针对 CHO 和 E.coli 宿主开发的试剂盒。以下以 CHO 相关产品举例。

1、CHO|360-HCP ELISA 的抗体和检测方法开发

多克隆 HCP 抗血清是通过用等量的源自模拟转染和发酵的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的CHO K1 和 CHO S 细胞的 HCP 对兔子和山羊进行免疫而产生的。使用不同制备的抗原：1）总 HCP ，或2）分子量分级 HCP（下表），每个HCP级分（低分子量、中分子量和高分子量）单独用于免疫，在纯化前汇集不同 HCP 级分的抗血清，通过使用针对总 HCP 的优化纯化策略获得单特异性多克隆抗体。这产生了一组四种不同的 HCP ELISA试剂盒（A ~ D型），它们共同构建了增强型通用 CHO|360-HCPELISA 试剂盒组合套装。

2、检测特异性

通过 CHO-HCP 标准品的二维 (2D) 凝胶电泳和相应的 A~D 型试剂盒的抗体进行免疫印迹，确定了所有四种测定对抗原的高特异性（图 1）。作为参考，将 HCP 的 2D凝胶电泳蛋白质图谱转移到硝酸纤维素膜上并用胶体金染色（图 2）

图1：显示 Biogene CHO 360-HCP 的抗体特异性，分别使用 A~D 型试剂盒抗体对经过2D 凝胶电泳的 CHO-HCP 标准品进行免疫印迹杂交

图2：显示了 CHO-HCP 的总蛋白分布。a）CHO-HCP 标准品在 2D 凝胶电泳后的考马斯染色；b）凝胶电泳印迹到硝酸纤维素膜后的胶体金染色

3、灵敏度

通过对 CHO-HCP 抗原进行考马斯染色，并用相应抗体进行 2D Western 印迹，确定了在所有四种检测中对抗原的高度特异性。对于所有四种试剂盒，检测下限（LOD）在0.5~1.0 ng/mL之间，定量下限（LOQ）为 2~3 ng/mL，工作范围 2~100 ng/mL。

4、回收率

CHO 360-HCP 试验旨在覆盖广泛的抗原，CHO|360-HCP ELISA 已在大量模拟 CHO-HCP 样本的基础上进行了广泛测试。所有样品均来自对应于某些生物制品生产过程的 CHO 细胞的模拟发酵。对于每个 HCP 样品，蛋白总量首先由 Bradford 确定。此外，每个样品都使用五种不同的 CHO-HCP 测定法进行分析：BioGenes 通用 CHO|360-HCP ELISA 类型 A ~D 和常用的一款商业化通用 CHO-HCP 测定法。

如下图，在样品 4 (x) 的情况下，使用类型 D回收率为测定估计为>90%。使用类型 A~C试剂盒的回收率要低得多，而使用那款商业化试剂盒测定的回收率仅为 20%。在大多数情况下（>65%），可用我们的四种通用 CHO|360-HCP ELISA（A ~ D 型）中的一种估计最佳的回收率。

不同HCP ELISA试剂盒在不同样品中的回收率表现

产品特色和优点

Biogenes的通用型 360-HCP ELISA试剂盒提供了A~D型四种选择（每种试剂盒使用不同的抗体组）。Starter Set入门套装（A~D型试剂盒各一套）可以快速轻松地选择最合适的其中一种。另外，使用360-HCP ELISA 检测试剂盒的优势如下所述：

• 更少的非特异性结合： 360-HCP ELISA 试剂盒使用链霉亲和素-POD 偶联物用于检测生物素标记的抗体，以获得可重复的结果、更少的非特异性结合和更低的背景噪音

• 即使用最高稀释度的标准品也能得到准确的结果：360-HCP ELISA 试剂盒提供未稀释的标准品以获得更高的产品稳定性、更准确的结果以及设置稀释范围的更大灵活性

• 自动洗板：可在自动洗板机和高通量系统中使用 360-HCP ELISA 试剂盒，建议在孵育期间振荡混匀

总结

根据Biogenes的数据和长期经验得出结论，没有一种通用的HCP检测方法适用于所有样本。 然而，在Biogenes的CHO 360-HCP分析中，通过A~D型四种不同试剂盒的组合，以及伴随的 2D 分析测试各个过程的模拟 CHO-HCP 以及多个过程控制样品（ICP）来确定，这种前期可行性测试可大大提高大多数样品的回收率。

为了选择性能最佳的试剂盒类型，使用 Starter Set 入门试剂盒套装对3~5个过程中样品在八个稀释度（2倍梯度稀释系列）和重复孔中进行分析。

下图显示了选择最佳检测试剂盒的一般流程。

首先，选择产生最高 HCP 信号的试剂盒类型。

其次，在下游纯化过程中，测得的HCP 水平应随着工艺进程明显降低。如果它们保持不变或仅略有下降，则可能是抗体与重组产物（DS药物）的交叉反应。在这种情况下，建议进行额外的测试，例如 1D 或 2D 免疫印迹。

最后，选择具有可接受的稀释线性的试剂盒类型，样品的不同稀释度应该存在稀释线性。

我们建议选择显示最高 HCP 值和可接受的稀释线性的试剂盒类型。如果试剂盒类型显示最高 HCP 值但没有或呈现不可接受的稀释线性，建议选择显示最佳稀释线性但 HCP 值较低的试剂盒类型。

如果四种试剂盒类型均不符合选择标准，则可能建议开发平台型或特定工艺过程的 HCP 检测 ELISA 方法。其他分析，例如使用 Mock HCP 和选定的抗 HCP 抗体进行的 2D 免疫印迹以及加标实验，可以帮助进一步评估 ELISA 方法的准确性。

选择最佳 CHO 360-HCP ELISA 试剂盒类型的一般流程