实时荧光定量PCR

Real-time qPCR实验是生命科学研究领域的一项必备技能。相比于常规的PCR实验，real-time qPCR灵敏度高，重复性好，已经被用于生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。它是对PCR扩增过程的实时监测，在PCR扩增的指数期间，Ct值（qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时所对应的循环数）和该模板的起始cDNA拷贝数存在线性关系，所以Ct值成为特定基因定量的依据。

由于最终结果中1个Ct的差异将反映初始模板的2倍拷贝数的差异，因此为了减少实验数据的偏差，通常要求实验结果中同一样本不同副孔的Ct值偏差越小越好，比如三副孔之间偏差小于0.3个Ct，甚至更低。为了实现这一目的，在qPCR实验的全流程中，扩增样品反应体系配制的精准度是非常重要的，它很大程度决定了后期实验数据的准确性和可信度。

同时，由于基础研究的效率提升，或者检测类的指标组合较多，通常在一次qPCR实验中，研究人员期望对多个cDNA模板进行多个基因的检测，这些模板可能来自于不同种类的样本，不同时间点的样本。每个cDNA模板又同时需要检测内参基因。模板和引物的每个组合通常都会做3~4个副孔，这样算下来，一次qPCR实验至少要一块96孔板或者384孔板，甚至更多板子。96孔板和384孔板中的qPCR反应体系常规设置为20ul和10ul，有时候为了节约试剂做更多的检测指标，会将反应体系分别降低到10ul和5ul。

I-DOT助力qPCR样品准备

那么针对如此复杂的实验组合和小体积的qPCR样品配制，传统手动配制的方式，如下面的问题，你是否都遇到过？而这些问题，通过德国DispendiX公司的I-DOT非接触式微量分液系统可以完全解决。

传统手动配制方式 VS I-DOT自动配制方式

I-DOT qPCR操作流程详解

我们以如下一个复杂的384孔的qPCR实验为例，整板实验包含了对8个cDNA模板进行16个引物对的检测，每个组合设置了3个副孔的实验。设定实验总体积为10ul，其中含有DNA结合探针/染料的Master mix为5ul，cDNA模板3ul，引物2ul（此处为了简化模拟实验模型，将相对均匀地分配10ul体系的组合，实际情况中，会使用到更低体积的模板或者引物）。

01- 排兵布阵

在软件Target Layout中通过选择、复制、移动的方式设置实验孔在qPCR板中的分布图，如上复杂的384实验设置在5分钟内可完成，设置完成后，软件记录了每个孔需要使用到的Master mix的体积，模板的种类和体积，引物的种类和体积，并同步计算整块384孔板所使用到的所有的液体种类和体积。无需任何人工计算。

02- 自动分配

在软件Source Layout中对照分布图，使用移液器将对应的液体种类的对应体积加入到对应的96孔pure plate板（母液板）中

03- 对号入座 & 模拟分配

将全新的qPCR板和已经加入待分配液体的pure plate板放入I DOT机器中，在Overview界面检查模板设置和进行模拟分配（模拟分配也可省略）

04- 一键启动

启动液体分配工作，5~15分钟完成自动分液工作。

05- 分配完成 & 质量监控

I-DOT软件的DropDetection功能可实时监测分液过程中的每一滴液滴，以及液滴中的气泡，这一简单有力的工具确保了液滴的有效分配和实验的最优化。DropDetection通过嵌置在样品板下方的电路板形成96个微小的光路屏障，检测不同位置样品孔中喷射出的液滴通过光路屏障时光强度的变化。在液体分配结束后，DropDetection可提供基于颜色编码或文本的监测数据。

*绿色代表滴液分配通过质控，红色代表发生错误，并且告知可能的原因

I-DOT 应用于qPCR的优势

· 直接分配原液，无需配置母管稀释液/混合液

· Pure plate孔的死体积<1uL，无试剂浪费

· 非接触式分液，无大量枪头使用；无枪头外壁挂液或孔内壁挂液现象；无加液过程引入的气泡

· 自动分配，无人工误差，无交叉污染

· 纳升级分液，100nl精度和准确度CV可低于8%，减少加样带来的Ct值偏差；可实现更小体积如2uL的qPCR反应体积，节省昂贵试剂和珍贵cDNA模板

· 软件设置简单快速，3~5分钟即可完成，模板可保存并进行调用

· 分配快速，无需人工看守，96孔板20ul反应体系5分钟完成分配，384孔10ul反应体系15分钟完成分配

· 总时长为人工分配的1/5左右

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