摘要

本研究在overlaytechnique液体覆盖技术 (LOT) 中使用 I-DOT，一种非接触式微量液体分配设备，助力细胞球体的形成。应用 LOT 技术可以抑制细胞附着到接种表面，以便细胞形成球体。目前有多种球体形成技术，但 LOT 技术可以满足研究人员对扩展性以及高重复性的需求，可产生具有形状统一，尺寸均一的球体。在这项研究中，我们使用 I-DOT 来分配人肺癌细胞系 A549，几天后细胞聚集生长形成球体。从第 0 天到第 14 天监测细胞，观察球体的直径和面积。结果表明，I-DOT可以分配固定数量的细胞，然后形成的细胞簇形状比使用手动移液分配细胞时形成的细胞簇更均匀。此外，I-DOT 系统的分配速度比手动移液快 10 倍。

引言

尽管2D癌细胞模型帮助我们了解体外致癌作用，但研究人员开始意识到使用平面模型研究复杂疾病存在局限性。因此，评估更准确的体外癌症模型以有效获取信息并找到替代治疗方法非常重要。 3D 模型比 2D 模型更接近地模拟体内细胞行为，使药物筛选分析更具预测性（Zanoni 等，2016）。

球体形成（图 1）是常见的基于液体的 3D 细胞培养方法。多细胞肿瘤球体通过自组装或被迫从单细胞悬液中生长在一起形成球体（Yamada 和 Cukierman，2007）。尽管有多种球体形成技术，但一项技术应当具有可扩展性和可重复性，才能用于临床前药物筛选（Costa 等人，2018 年）。 LOT 因其低成本、易于处理以及可扩展性和可重复性的巨大潜力而成为探索较多的方法。它可以抑制细胞粘附在它们所接种的超亲水表面上（Costa 等人，2018 年；Carvalho 等人，2017 年）。当细胞与表面相互作用被抑制时，细胞间相互作用会更加突出，从而增强聚集，导致大多数细胞在 1 到 3 天内形成球体（Costa 等，2018）。

图 1. 通过液体覆盖技术 (LOT) 形成的 A549 球体图像。

本研究旨在确定 I-DOT（图 2），一种使用自动化和优化方案的微量非接触式液体分配系统，是否可以与 LOT 技术相结合，分配指定数量的A549 细胞到目标孔板，细胞液滴的体积可以从纳升到几微升，然后形成具有高通量和高均一体积的肺癌球体，同时保持细胞活力。

图 2. I-DOT 是一种微量非接触式分液设备，用于执行液体覆盖技术 (LOT)。

材料和方法

细胞培养

人肺癌 A549（图 3）细胞系使用 RPMI 1640 培养基（Thermo Fisher，MA，US），该培养基含有 10% 胎牛血清（Thermo Fisher，MA，US），100 U/mL青霉素和 100 µg/mL 链霉素（Thermo Fisher，MA，美国），在37°C，5% CO2 环境中培养。使用I-DOT进行分配前，细胞汇合度达到 85%±5%。

图3 A549细胞明场图像

单细胞悬液制备

去除细胞培养基 (RPMI)，用磷酸盐缓冲盐水溶液 (Thermo Fisher, MA, U.S.) 洗涤，并与 TrypLE (Thermo Fisher, MA, U.S.) 在 37°C 和 5% CO2 环境中孵育 5 分钟。使用 RPMI 培养基清洗烧瓶以收集培养表面上的任何残留细胞并中和 TrypLE。将含有 RPMI 培养基和 TrypLE 的细胞溶液吸入离心管中，180 RCF 离心 3 分钟。去除上清液，将细胞沉淀重悬于 RPMI 培养基中。通过将 10 µL 单细胞悬液和 10 µL 台盼蓝（Thermo Fisher，MA，US）混合均匀，吸取 10 µL 样品混合物滴加到 Countess Cell Counting载玻片上（Thermo Fisher，MA，US），并将载玻片插入 Countess II 自动细胞计数器（Thermo Fisher，MA，U.）中进行计数

I-DOT校准

I-DOT Assay Studio 软件中的液体类别校准选项用于校准研究中使用的各种液体。使用该校准功能，将 20 µL 溶液添加到源孔中并进行分配。I-DOT 根据已知体积、施加的压力和源孔下方传感器的反馈计算液滴尺寸。建立标准曲线以实现I-DOT对于某液体的参数校准工作。校准的液体是 RPMI 培养基和 RPMI 培养基中的 A549 细胞。

A549 球体形成与 I-DOT

在I-DOT Studio Assay 中进行分配程序设定，其中在 2个源孔中加入30ul RPMI 培养基（含A549细胞），并将其分配到384 孔圆底超低附着 (ULA) 微孔板（康宁，纽约，美国）中。使用 RPMI 培养基制备 A549 单细胞悬液，细胞密度为 40,000 个细胞/mL。将单细胞悬液滴加到源孔中，并使用 I-DOT 分配到 ULA 板中的目标孔中。为了进行比较，使用 Eppendorf Research Plus 单道移液器（Eppendorf AG，德国）将 30 μL 的单细胞悬液手动移入 ULA 板中的其他空孔中。 ULA 板在 180 RCF 下离心 3 分钟，并在 37°C 和 5% CO2 环境中培养 2 周。每天使用4 X的明场显微镜为每个孔获取图像。

测量球体面积

使用 ImageJ 分析从球体形成实验中获得的图像以确定球体的直径。 A549 球体的 X 和 Y 直径在第 4 天测量并取平均值以找到总直径。在 X 方向或 Y 方向上在球体上画一条线，用于计算球体的 X 和 Y 直径（以像素为单位）。直径被转换为 µm，0.62 像素等于 1 µm。球体的总直径是通过平均球体的 X 和 Y 直径来计算的。将直径转换为 µm 后，计算半径。半径用于计算球体面积。

结果和讨论

I-DOT 分配后的细胞活力

使用 I-DOT，我们证明分配后细胞活力没有受到很大影响。I-DOT 分配后所有孔的平均细胞活力为 94% ± 5%，如图 4 所示。放置在源孔中的细胞悬浮液的细胞活力为 96% ± 2%。

图 4. 描绘活细胞（绿色）和非活细胞（红色）的荧光图像（10X）

与手动移液相比，使用 I-DOT 形成 A549 球体

I-DOT 成功地将 A549 细胞分配到圆底 384 孔 ULA 板中，导致肿瘤球体形成。从第 0 天到第 14 天，每天对这些球体进行监测，以查看它们是否会保留球体形状（图 5）。与手动移液相比，这些球体的形状更加紧凑和均匀，如下图所示（图 6）。使用 I-DOT，在一个完整的 384 孔板中分配 20 µL 培养基和细胞需要 3 分 25 秒，而手动移液需要大约 32 分钟。

图 5. 使用 I-DOT 在 384 孔 ULA 板中形成 A549 细胞的球体。从第 0 天到第 14 天，每天监测 A549 细胞（n=6）。在第 0、1、4 和 14 天分配后拍摄 A549细胞的明场图像（4X）

图 6. 使用手动移液在 384 孔 ULA 板中形成 A549 细胞的球体。从第 0 天到第 14 天，每天监测 A549 细胞（n=6）。在第 0、1、4 和 14 天分配后拍摄 A549 细胞的明场图像（4X）

球体的直径和面积

使用 I-DOT 和手动移液将 A549 细胞分配到 384 孔板的中。 4 天后，测量这些球体的直径和面积，以查看这些球体的均一性。如下所示（表 1），在第 4 天测量的球体的直径和面积在使用 I-DOT 的所有孔中的形状和大小相似，而手动移液则不一致。

表 1. 基于第 4 天测量的六次重复的球体直径和面积的总结。

结论

这项研究为 I-DOT 用于球体形成的能力提供了许多见解。总之，我们的数据支持 I-DOT：

• 可以分配细胞活力高的细胞，表明自动分配不会影响细胞活力。

• 与手动移液相比，分液速度大约快 10 倍。

• 相比较手动移液，I-DOT分配细胞后形成的球体尺寸和形状更为均一。

参考文献

1. Zanoni, M., Piccinini, F., Arienti, C., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports, 2016; 6: 19103.

2. Yamada, K. M. and Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell, 2007; 130(4): 601-610.

3. Costa, E. C., Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., et al. Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlaytechnique: considerations and practical approaches. Biotechnology Journal, 2018; 13(1): 1-12.

4. Carvalho, M. P.,Costa, E. and Correia, I. J. Assembly of breast cancer heterotypic spheroids on hyaluronic acidcoated surfaces. Biotechnology Progress, 2017; 33(5): 1346-1357.