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使用Incubox细胞孵育箱降低边缘孔效应(edge-effects)并减少孔间差异
发布时间:2022/08/15 点击数:

简介

近年来,体外3D细胞模型在药物发现等项目中的应用不断扩展。稳定和准确的实验数据要求细胞模型能够经受多次的给药、测试和长达数周的培养,这对培养环境提出了挑战——如何长期、可控地保持温度和湿度在适宜范围内。


目前在培养过程中经常遇到的不稳定因素有许多,例如繁忙的项目中培养箱门经常开闭导致的箱内温、湿、气体浓度等条件变化显著,而湿度不足又会造成培养基的大幅蒸发,对药物浓度和细胞状态等造成影响。对于细胞培养板而言,边缘位置的培养孔湿度低于中心位置的培养孔,因此培养基蒸发的也更为明显,被称为边缘孔效应(edge-effects)。


边缘孔效应对于长时间周期的研究来说是一个不容忽视的问题——随着培养基的蒸发,孔内的培养基成分和药物浓度将增加,这可能导致孔内沉淀的出现,并增加孔间的数据差异。许多的研究人员会通过避免使用边缘孔来提高数据可重复性,从而浪费了多达38%的培养孔——对于96孔板而言,外围的36个孔将被弃用。因此,实验组须分布在多块培养板上以达到足够的通量,增加了工作量和成本,同时降低了实验中培养板布局的灵活性。


本应用说明中展示了一项为期14天的毒性检测实验,用于检测药物诱导的肝损伤(DILI)[1]。实验过程涉及间隔5天的重复给药,并使用InSphero的Incubox细胞孵育箱(CS-10-001-00)减弱边缘孔效应和孔间差异,从而完整地使用整块96孔培养板。


一、产品介绍

InSphero Incubox细胞孵育箱是一种特殊设计的小巧容器,可以直接放在传统的二氧化碳细胞培养箱中,营造稳定温度和湿度的局部环境,减少培养箱门打开时箱内湿度和温度的波动(图1)。Incubox的尺寸是350mm x 375mm x 210mm,最多可以装载20块标准尺寸的细胞培养板,其磁性闭合系统允许进行单手的开关操作,赋予使用者良好的使用体验。Incubox由铝、不锈钢和钢化安全玻璃(ESG)制成,可以经受常规的清洁和消毒,并与培养箱常用的各种溶剂和去污程序兼容。


此外,Incubox还配有独立的水浴槽帮助维持箱内湿度,背部有孔洞确保气体交换顺畅并帮助保持箱内的氧气和二氧化碳浓度。

图1:InSphero Incubox细胞孵育箱(CS-10-001-00)


图2比较了二氧化碳培养箱和Incubox细胞孵育箱在经历8个小时的数次开闭后内部相对湿度测量值的变化。打开二氧化碳培养箱的门会导致箱体内的湿度显著下降,大约30分钟后才会逐渐恢复到90%以上,而同时段Incubox内的相对湿度保持不变。打开二氧化碳培养箱和Incubox的门会导致两个箱体内的湿度下降,但是Incubox内的湿度变化幅度远小于二氧化碳培养箱内的湿度变化,且可以在几分钟内恢复到较高水平。因此,使用Incubox进行培养,细胞培养板的孔内蒸发量,尤其是边缘孔的蒸发量将大大减少。

图2:二氧化碳培养箱及Incubox细胞孵育箱内相对湿度随箱门闭合的变化


图3显示了在二氧化碳培养箱和Incubox细胞孵育箱(使用前平衡至少1h)中放置5天的培养板,各孔内剩余的培养基体积。

图3:细胞培养板换液后5天孔内剩余培养基体积(初始70μl)


二、14天周期细胞毒性检测实验

1、简介

本研究在一项长达14天的药物测试实验中评价了Incubox对于实验数据稳定性的影响。实际上,类似的实验常被用于评估药物引起的药物性肝损伤(DILI)。在本次实验中,使用原代人肝脏微组织(肝细胞/非实质细胞共培养)测试了不同浓度的化合物。整个实验周期超过14天,每4至5天将更换培养基并重新给药,以便研究代谢物的影响。对于这样长周期的细胞培养而言,减少实验中培养基的蒸发至关重要。


2、实验安排

商业化的器官微组织可以直接从供应商处购买,并使用Akura 96孔微球培养板(CS-09-004-03)和InSphero验证的实验方案进行培养[2]。实验安排如图4所示:在第0、5和9天更换培养基,并加入不同浓度的测试药物——氯丙嗪(一种已知的具有肝毒性的物质)。图5展示了细胞培养板的布局,两块相同排布的培养板分别置于二氧化碳培养和Incubox细胞孵育箱中培养。细胞培养板的每个孔内养有一个肝脏微组织,每一列孔内的细胞给不同浓度的氯丙嗪,并于第14天使用3D细胞活力检测试剂(Promega,CellTiter-Glo 3D assay)测定细胞ATP水平[3]。本实验中,仅A-D行孔内的细胞被用于检测。

图4:实验安排


图5:细胞培养板内药物浓度安排


3、结果

自第0天起,在培养后第5天(期间未更换培养基)进行扫描成像(图6上图)。在标准培养箱条件下培养的平板显示出受损的肝微组织,这可能是由于外层孔中的蒸发增加所致。在二氧化碳培养箱中培养的平板的A行孔内,可以清楚地看到沉淀的出现和较为疏散的微组织。然而,在Incubox中培养的整个平板孔内可以观察到较为良好的均匀性(图6下图)。

图6:培养5天后的扫描成像


图7显示了培养14天后通过测量细胞ATP含量得出的微组织活力。热图显示,在二氧化碳培养箱中培养的培养板(图7左图)A行孔内,低氯丙嗪浓度时细胞的活力有显著下降。这些结果表明,细胞活力受到培养基蒸发的影响。相反,在Incubox中的培养板(图7右图),从A行到D行孔内,可以观察到较为稳定的、剂量依赖的活力衰减。

图7:培养14天后细胞ATP含量测定值


为了阐述培养基蒸发效应对于实验稳定性的影响,绘制了不同培养条件下B-D行孔内或A-C行孔内(n=3)的剂量-活力曲线。B-D方案模拟了仅使用96孔板的内部60孔开展实验的场景,研究人员经常选择这种方法来防止边缘效应。在两种不同培养条件下,均可以获得较为稳定的实验数据以及平滑的剂量相应曲线。A-C方案模拟了使用96孔板的所有孔开展实验的场景(包括边缘孔),二氧化碳培养箱中培养板的实验数据具有较大的变异,尤其是在低化合物浓度下。而对于Incubox中的培养板, 由于边缘孔效应的减弱,B-D行和A-C行之间的数据稳定性没有太大差异。


4、结论

Incubox细胞孵育箱在标准的二氧化碳细胞培养箱内创造高湿度的局部环境,使得二氧化碳培养箱门的开闭仅对Incubox内的湿度波动产生较小影响。因此,培养板中的培养基蒸发量显著减少。在本实验案例中,边缘孔效应大幅减弱,从而允许使用者充分利用96孔板的所有培养孔,且减弱了由于培养基蒸发造成的数据波动。使用Incubox进行细胞培养,96孔板中的所有孔都可以用于产生稳定的实验数据,且使得培养板具有更高的灵活性并在单板上测试更多的实验条件,最终减少工作量和成本。


三、参考文献

1. Proctor, William R., et al. “Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury.”Archives of toxicology 91.8 (2017): 2849-2863.

https://doi.org/10.1007/s00204-017-2002-1


2. Messner, Simon, et al. "Transcriptomic, proteomic, and functional long-term characterization of multicellular three-dimensional human liver microtissues.” Applied in vitro toxicology 4.1 (2018): 1-12.

https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/aivt.2017.0022


3. Promega CellTiter-Glo 3D Cell Viability assay protocol.

https://ch.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/celltiter-glo-3d-cell-viability-assay-protocol.%20pdf?rev=88083aa3f7284e898ff0f218aa3c6b59&sc_lang=en