3D细胞培养技术的诞生为科研人员提供了更贴近真实体内环境的细胞模型，使他们可以在体外开展更具有洞悉力和预测能力的细胞实验，减少药物研发失败风险，缩短实验周期并降低研发成本。3D细胞培养技术在药物研发、干细胞培养、器官再生等研究领域已经展现出了出色的表现。

2D细胞培养方法和3D细胞培养方法的比较

(图片来自于网络)

3D细胞培养技术经历了数十年的持续发展，其应用方法也在不断革新。目前的3D细胞培养方法依据其培养原理，主要分为基于支架的3D细胞培养方法和无支架的3D细胞培养方法两大类。其中后者因其操作简单方便、适合高通量的自动化操作、可以良好地模拟细胞微环境等特点被广泛地接受和应用。

无支架的3D细胞培养方法依赖细胞自聚集的特性使得细胞聚集成微球并保持三维构型进行培养。无支架的3D细胞培养方法中，最为常用的两种是：

（1）使用超低吸附材质（Ultra Low Attachment）的细胞培养耗材进行培养；

（2）在液体悬滴（Hanging Drop）中进行细胞培养。

ULA耗材培养方法（左图）和悬滴培养方法（右图）

(图片来自于网络)

上海曼博生物提供瑞士InSphero公司的3D细胞培养耗材和工具，其Akura系列超低吸附微球培养板和Akura PLUS悬滴细胞培养系统是一种简单、灵活且能兼容自动化操作和细胞成像平台的3D细胞解决方案，适用于无支架的3D细胞模型的形成、培养、观察和观测。

ULA培养板（左图）和悬滴系统（右图）

关于瑞士InSphero公司

InSphero AG是瑞士苏黎世联邦理工学院和苏黎世大学的衍生公司，于2009年在瑞士施利伦成立，在美国和德国设有分部。公司以“预测人体对于治疗方案的真实反应以改善世界范围内的病人生活”为愿景，是通过3D细胞培养技术开展新药测试的领军型服务商之一，为世界前十的知名药企和化妆品制造企业提供过相关服务。

InSphero的3D细胞培养耗材和工具是公司在开展服务时依据实验过程中的诸多痛点问题研发和制造的产品，也是该公司日常开展3D细胞培养时会大量使用到的。

Akura系列超低吸附微球培养板

InSphero提供96孔和384孔两种型号的超低吸附微球培养板，其外观和常规的细胞微孔板相同，尺寸符合SLAS国际标准，可以轻松兼容各种相关的操作和仪器。

Akura系列96孔（左图）和384孔（右图）微球培养板

Akura系列超低吸附微球培养板用法简单、易于上手，其实验操作流程和传统的细胞培养实验相同，主要包括细胞铺板、细胞培养、实验操作和样品收取，所有的步骤都可以在一块培养板中完成，避免了繁琐的耗材更换或细胞转移。适用于常规细胞类型的3D培养实验。

96孔（左图）和384孔（右图）培养板的操作流程

从近处观察不难发现Akura系列超低吸附微球培养板的精妙设计之处：

96孔（左图）和384孔（右图）ULA微球培养板

（1）细胞孔的超低吸附涂层经久耐用，可以保证长时间周期的细胞培养过程中不发生细胞贴壁的现象，亦不会从孔内脱落而黏附到细胞表面；

（2）细胞孔的底部拥有一个类似倒置烟囱形状的深孔，可以为孔内的细胞提供额外的保护（其中96孔板的深孔结构是对称的，384孔板的深孔结构是非对称的）；

（3）深孔的上方有一个称为SureXchange的小巧平台，可以供移液吸头停靠方便培养基更换；

（4）深孔的底部是直径为1mm的平底观察窗，可以进行方便和快速的观察以及不失真的细胞成像；

（5）96孔超低吸附微球培养板拥有经过改良设计的细胞板盖，可以有效减少培养基的蒸发；其底部厚度为0.8mm的COP材质，优秀的光学特性带来更清晰的成像体验；

（6）384孔超低吸附微球培养板的板壁为黑色，可以有效减少光学检测实验中的孔间信号串扰；其底部是厚度为20um的气透膜，方便气体的交换并适用于高内涵细胞成像实验。

独特的设计使得Akura系列超低吸附微球微孔板在3D细胞培养的应用中拥有出色的表现，为客户带去全新的操作体验，帮助使用者提高实验成功率和稳定性。

与市面上常见的U型底的超低吸附细胞培养板相比，Akura系列超低吸附微球培养板的深孔和SureXchange设计可以使得培养基更换更加彻底（效率>90%）且对细胞微球的扰动更小，由此带来了更高的洗涤效率和更低的微球损失率。

Akura系列ULA微球培养板 VS U型底ULA细胞培养板

左图：多次培养基更换操作后化合物残留情况（绿色线条表示Akura系列ULA板，其余线条表示不同百分比残留的培养基更换策略下的U型底ULA板）

右图：多次培养基更换操作后细胞微球损失情况（绿色线条表示Akura系列ULA板，其余线条表示不同百分比细胞微球丢失时的U型底ULA板）

在长周期培养的药物测试应用场景下，耐用的超低吸附涂层和低细胞微球丢失率可以轻松应对长达4周的细胞培养需求。高洗涤效率保证了药物浓度始终维持在较为稳定的波动范围内，药物浓度更加精准，药物测试结果更加真实可信。

长周期培养过程中化合物浓度波动情况（绿色线条表示Akura系列ULA板，红色线条表示50%残留的培养基更换策略下的U型底ULA板）

U型底的超低吸附板会造成细胞成像时的图像扭曲，只能用于简单的观测，不适合有高分辨需求的细胞成像应用场景；而常规的平底超低吸附板又因为底部面积大造成细胞分散难以聚集成球因此表现不佳。

Akura系列超低吸附微球培养板的平底深孔设计很好的平衡了这两方面的因素，在实现良好的细胞聚集效果的基础之上满足客户清晰、不变形的细胞成像需求。其中，Akura 384孔超低吸附微球培养板底部的气透膜厚度仅为20um，适用于高内涵细胞成像的应用场景。

Akura 384孔超低吸附微球培养板和竞品U型底超低吸附细胞培养板的成像效果比较

Akura系列超低吸附微球培养板的尺寸符合国际标准，可以兼容自动化的液体处理系统以实现高通量的实验操作。在使用自动化液体工作站时，需要将吸头设置为偏离中轴线1mm，并设置移液速度为中低速。为此，InSphero公司为常见的自动化液体工作站的设置参数提供了参考方案，研究人员可以以此为基础快速开展实验。

因为上述的诸多特性，科研人员使用Akura系列超低吸附微球培养板进行3D细胞培养可以得到更加稳定和具有洞悉力的3D细胞模型。通过细胞自聚集的实验原理，使用者可以通过控制种植的细胞密度来实现对细胞微球大小的控制。在单次实验中细胞孔中长成的细胞微球直径可以达到200um左右，且各个孔中的细胞微球大小均一、稳定性良好；在多次重复实验中，各个批次的细胞微球均一度高、细胞大小和代谢能力相近、批间差异小，有助于科研和工业客户在整个实验周期中得到更加真实和可靠的实验数据。

单次实验得到的细胞微球的直径均一性（左图）和多次实验结果的批间稳定性（右图）

Akura PLUS悬滴细胞培养系统

InSphero提供具有特殊设计的3D细胞培养悬滴系统，该系统由一块Akura PLUS悬滴板（用于细胞聚集成球的环节）和一块Akura 96孔超低吸附微球培养板（用于后续的长期培养、高分辨成像和药物测试等环节）构成，适用于较难进行聚集的细胞类型的3D培养实验。其使用方法简便，实验操作流程主要包括悬滴形成、微球成熟、微球转移等步骤，所有的步骤都可以兼容常规移液器、多通道移液器和自动化液体工作站。

Akura PLUS悬滴系统（左图）和操作流程（右图）

Akura PLUS悬滴细胞培养系统中的悬滴板中配有一块加湿垫，可以增加板内的湿度以保持悬滴的稳定。加湿垫的中部开有正方形的观察窗，方便用户进行简单的细胞观察以确定细胞聚集情况和最佳的微球转移时间。

显微镜下观察到的悬滴中的细胞随时间的聚集情况

悬滴板和培养板的对应位置设有三个插销结构，帮助确定悬滴板和培养板的相对位置。在进行微球的转移时，只需要将悬滴板置于培养板上方并向悬滴板中加入新的培养基，包含了细胞微球的液滴就会落入下方培养孔的相应孔洞内。

步骤一：将单细胞悬液移入悬滴板中形成悬滴

步骤二：悬滴中的细胞聚集形成细胞微球

步骤三：将悬滴板中包含细胞微球的悬滴转移至培养板中

步骤四：在培养板中长期培养细胞并更换培养基

3D细胞培养耗材的选择指南

InSphero 3D细胞培养工具

除了3D细胞培养耗材，InSphero还专门研发了3D细胞培养的相关工具，可以辅助研究人员更好的开展实验。

斜立支架（左图）和细胞孵育箱（右图）

Akura斜立支架：可以帮助细胞培养板保持30度角倾斜，通过将细胞引导至孔的边缘，促进细胞间的有效聚集并提高细胞微球的均匀性。支架由阳极氧化铝材质制成，可以经受常规的清洁和消毒并反复使用。单个Akura斜立支架最多可以堆叠4块Akura系列超低吸附微球培养板。

InSphero细胞孵育箱：是一种特殊设计的容器，可以在常规的细胞培养箱内形成局部的高湿度环境，减少培养箱开关门时湿度的波动对细胞培养板的影响。使用孵育箱可以有效降低细胞培养板中的培养基蒸发，减弱边缘孔效应对实验造成的不良影响并提高孔板的利用效率。

开关培养箱/孵育箱门时对细胞孵育箱（橙色线条）和二氧化碳细胞培养（黑色线条）内湿度的影响

孵育箱配有独立的水浴槽帮助维持箱内湿度，背部有孔洞确保气体交换顺畅并帮助保持箱内的氧气和二氧化碳浓度。孵育箱的磁性闭合系统允许进行单手的开关操作，赋予使用者良好的使用体验。孵育箱由铝、不锈钢和钢化安全玻璃（ESG）制成，可以经受常规的清洁和消毒。单个InSphero细胞孵育箱最多可以堆叠20块Akura系列超低吸附微球培养板。