背景

干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团，一般受精后的约第5天形成人囊胚，每个早期的囊胚包含两种细胞：滋养层细胞产生胚胎的支持组织如胎盘；而内细胞群则可发育成内、中、外三个胚层，最终发育成完整的个体。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞（ES），ES细胞具有无限增殖和多能甚至全能分化的能力使其在揭示生命、药物筛选、新药开发，移植治疗及研究胚胎发育和疾病发生和遗传性疾病具有广阔的应用前景。（参考文献）

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饲养层细胞培养法是一类经常使用的胚胎干细胞的体外培养方法，本文中主要分享的是在饲养层hESC培养体系中如何采用一种无EDTA温和的GMP级胶原酶溶液的方法进行hESC传代的方法。

一、实验材料准备

1. 成纤维细胞饲养层包被的培养板

2. 细胞刮刀

3.  hESC 培养基

制备500ml完全培养基，将以下组分混合后过滤：

  a. 390 ml ESC基础培养基Knock-Out DMEM (Invitrogen) 

  b. 5 ml L-谷氨酰胺溶液(Invitrogen) 

  c. 5 ml 非必需氨基酸溶液 (Invitrogen) 

  d. 100 ml Knock-Out 血清替代物(Invitrogen) 

4. hESC 完全培养基中添加bFGF

  a. 制备50 μg/ml bFGF储存溶液：在1ml无菌蒸馏水溶解50 μg bFGF（美国Akron品牌cGMP rHu bFGF-155）, 过滤并分装，存储在-20℃备用；

  b. 制备含50 ng/ml bFGF的hESC培养基工作液: 在使用前在每1mL hESC完全培养基中加入1 μl bFGF储存原液制备成hESC工作溶液；

5. 胶原酶NB6 (Nordmark) 

  a. 制备20 mg/ml胶原酶NB6储存溶液：将1 g胶原酶NB6产品溶解在50 ml的含钙镁离子的PBS缓冲液（PBS+）中，按照0.5ml/支分装后储存于-20℃备用。

  b. 制备1.25 mg/ml胶原酶工作溶液：每0.5ml NB6胶原酶储存溶液加入7.5 ml of PBS，配制成浓度为1.25 mg/ml的胶原酶工作溶液。

二、hESC传代-胶原酶法

注意：所有实验步骤遵照无菌操作规范在生物安全柜中操作。

1. 将PBS+缓冲液和人ES细胞培养基在37℃和5%的CO2环境中平衡；

2. 通过剥离和抽吸操作从培养物中去除分化/囊性物质。

3. 从培养容器中吸取培养基，用PBS+缓冲液冲洗两次。

4. 加入胶原酶工作液(例如:器官培养皿加0.5 ml，6cm直径培养板或25cm²细胞培养瓶加入1 ml，75 cm²长烧瓶计入3 ml)，在37℃孵育6-8min。

5. 吸出胶原酶溶液，加入适量hESC培养液。

6. 使用移液器从器官培养皿中收获克隆菌落，或者需要从培养瓶中收集细胞克隆时，可以用细胞刮板轻轻地刮下菌落。

7. 将细胞悬浮液转移到合适的离心管中，并使用移液器轻柔吹吸使细胞分散（获得原成熟菌落的1/10 -1/20大小的细胞团）。

8. 用培养基清洗培养容器一次，并将培养基转移至离心管中。

9. 1200rpm，离心3min。弃上清，用bFGF的hESC完全培养基重悬细胞沉淀。

10. 提前向成纤维细胞饲养层包被的培养板中添加适量含bFGF的新鲜hESC培养基，将细胞悬液转移到上述培养板中。

11. 补足培养基并摇匀，确保hESCs均匀分在培养板中。

12. 37℃，5%CO2条件下培养。

更多的胶原酶应用于间充质MSCs干细胞原代培养以及后续生物反应器中微载体上细胞消化实现工艺放大的解离应用请联系上海曼博。

参考文献

1- Kiatpongsan S, Tannirandom Y, Virutamasen P. Introduction to stem cellmedicine(J]. Med Assoc Thai ,2006;89(1) :111-7.