一、简介

脂肪组织一直被认为是多种分化潜能的多功能细胞类型包括干细胞的丰富来源，一般可通过抽脂的方法收集。基质血管成分细胞(SVF) 从脂肪组织提取出来的异质性混合细胞群体，含有可塑性较高的脂肪组织来源的间充质干细胞，SVF从脂肪组织中分离后可用于直接应用或在进一步的细胞分化以产生特定的细胞类型（文献1）。今天小编主要给大家分享的是利用Nordmark 无动物源GMP级胶原酶和中性蛋白酶组合从脂肪组织中分离提取SVF的实验相关流程Protocol。

（图）无动物源胶原酶AF-1 GMP级和中性蛋白酶AF GMP级胶原酶组合

二、实验准备

酶溶液制备

将0.4 PZU/ml无动物源GMP级胶原酶AF-1和0.2 DMC U/ml中性蛋白酶用乳酸盐林格（LR）溶液溶解制备酶工作溶液，请确保酶溶液液完全溶解且配好后一直置于冰上直至使用。如果您计划使用别的缓冲液，请确保该缓冲液中Ca²⁺的浓度不低于2mM更有助于胶原酶的活性发挥。

脂肪提取和洗涤

取用200ml原抽脂液(大概会析出50-100ml脂肪组织)，建议在吸脂液在新鲜的状态立即进行实验。

1、将抽脂液加热至37 – 38℃

2、将预热过的抽脂液用LR溶液通过摇晃和倾析法清洗3次直到脂肪相呈黄色，液体相呈透明(淡粉色)。每次洗涤后将底部的水相完全去除，然后再处理上层相的脂肪组织。

3、第三次洗涤后静置至少5分钟。除了倾析法也可以通过在室温下200g离心5分钟实现脂肪的提取分离。

一般离心后会有三层：

第一层：脂肪组织

第二层：膨胀的一些废弃物

第三层：红细胞和细胞外基质(ECM)材料

4、使用60ml导管尖端注射器抽吸洗净和析出的上层脂肪组织，并将其转移到适当的管或容器中。

SVF提取

获得脂肪组织后可以直接进行脂肪组织消化步骤，主要步骤如下：

1、在脂肪组织样品中加入相同体积的酶溶液(脂肪组织与酶溶液比例1:1)，即10g脂肪组织处理加入10 ml含酶的LR溶液(GMP级别的0.4 PZ U/ml胶原酶AF-1和0.2 PZ U/ml中性蛋白酶AF级)。最终解离溶液中AF-1 GMP级终浓度大致为0.2 PZ U/ml，中性蛋白酶的终浓度大致为0.1 DMC U/ml。

2、解离工作溶液放置在摇床中37℃恒温以150转/分摇50分钟

3、离心和SVF颗粒重悬

4、600克离心10分钟会拿到三层溶液，分别为:

第一层：分解的组织碎片

第二层：废弃物

第三层：SVF颗粒和ECM材料

取上清，加入1ml LR溶液通过冷却或稀释办法停止酶解离工作，在这过程中请确保细胞良好的悬浮状态。

5、抽吸整个SVF悬浮细胞，通过400微米的细胞过滤器过滤将SVF细胞与ECM材料分离，并收集到一个新的容器中。

6、彻底摇匀样品并根据需要进行细胞计数

三、SVF和ASC提取的应用文献清单

Nordmark胶原酶NB系列产品提供从科研到GMP级的全线组织细胞解离方案，同时为方便用户使用提供优化过的细胞解离Protocol和各类应用的大量文献支持。以下是小编选择部分关于SVF以及脂肪干细胞（ASC）的相关文献清单分享：

更多应用文献以及protocol请联系上海曼博生物。

文献参考：

1. Oedayrajsingh-Varma MJ, van Ham SM, Knippenberg M, et al.Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure[J].Cytotherapy,2006,8:166-177.