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Qkine细胞因子:iPSC向三胚层分化系列--中胚层
发布时间:2024/11/14 点击数:

诱导性多能干细胞(iPSC)分化为中胚层

iPSC向三胚层分化系列,将分别介绍诱导多能干细胞(iPSCs)分化为外胚层(点击查看)、中胚层和内胚层谱系过程的Protocol,本期将重点讨论将 iPSC 分化为中胚层细胞的Protocol。


无饲养层人类诱导性多能干细胞 (iPSC) 分化为中胚层细胞是一个复杂的过程,需要使用诸如激活素 A、BMP4和FGF2等生长因子。此外,还需要 CHIR99021 和磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3-激酶) 抑制剂 LY294002 等因子来提高分化效率并稳定中胚层命运。这种组合使研究人员能够可靠地生成功能性中胚层细胞,用于各种生物医学应用。


在本应用说明中,我们概述了使用含有重组 FGF2 家族成员(如 Qkine FGF2-G3 (Qk053))以及激活素 A (Qk001) 和 BMP-4 (Qk038) 生长因子的培养基将 iPSC 分化为中胚层细胞的方法。中胚层标记物表达用于通过免疫细胞化学评估成功分化。


01   介绍

人类诱导多能干细胞 (iPSC) 是一种体外模型,代表了再生医学和细胞生物学的关键突破。iPSC 是通过引入特定转录因子将成年体细胞重新编程为多能状态而产生的。重新编程 iPSC 使这些细胞能够分化为三个胚层中的任何细胞类型:外胚层、中胚层和内胚层。这为疾病建模、药物发现和细胞疗法提供了无与伦比的潜力,而所有这些都没有使用胚胎干细胞所带来的伦理问题[1]。


鉴于中胚层在生成各种重要组织和器官(包括心脏、血液、肌肉和骨骼)方面发挥的作用[2],将 iPSC 分化为中胚层细胞系尤为重要。


iPSC 分化为中胚层细胞的过程通常涉及在体外模拟胚胎发育阶段。在胚胎发生过程中,中胚层的形成由一系列信号通路启动,包括 nodal、Wnt 和骨形态发生蛋白 (BMP),这些信号通路对于中胚层特化和随后的中胚层发育至关重要[3]。为了在受控的实验室环境中模拟这些条件,研究人员利用特定的生长因子和小分子通过类似的发育信号来引导iPSC。


iPSC 成功分化为中胚层细胞并非没有挑战。由于 iPSC 系内存在差异,分化效率以及不完全或混合谱系分化的可能性是研究人员继续解决的重大障碍。可以通过研究转录因子标记(如 brachyury 和 MIXL1)的表达来评估成功率[4]。


02   材料和方法

1.细胞培养和维护

每周使用 0.5 mM EDTA 传代两次 iPSC 以分离,然后以 1:6 的分流比接种在玻璃粘连蛋白vitronectin ( Qkine,Qk120 ) (5 µg/ml) 包被的 6 孔板中,并在 E8 类培养基中培养。传代后的第二天,去除用过的培养基,用 5 ml E8 类培养基替换,使细胞遵循周/末无培养基更换模式。有关此过程的更多信息,请点击参阅我们的指南,使用 Qkine 的耐热 FGF-2 (bFGF) 以及我们的无动物来源 TGF-β1 和玻璃粘连蛋白vitronectin进行weekend-free 的iPSC培养,以提高菌落同质性。


2.iPSC 分化为中胚层

中胚层分化工作流程示意图(图 1)概述了 iPSC 分化为中胚层的步骤以及通过测试中胚层表达标记来评估分化的步骤。


图1.中胚层分化和评估测试时间表


使用 Accutase 分离 iPSC ,并以 1,000 个细胞/孔的密度接种在涂有 vitronectin ( Qk120 ) (5 µg/ml) 的 96 孔板中,该板中的 E8 类培养基含有 ROCK 抑制剂 (Y-27632, 10 µM)。第二天,即第 1 天,用新鲜制备的中胚层培养基喂养细胞(表 1)。第 2 天和第 3 天更换培养基,使用新鲜制备的中胚层培养基。


表1.日常中胚层培养基配制成分,各成分在使用前无菌添加


表2.CDM-PVA培养基配制成分,各成分无菌添加,并在使用前过滤培养基


3.免疫细胞化学

在第4天,细胞用4%多聚甲醛固定,并用10%驴血清(稀释在0.1% Triton X-100中)进行封闭和透化。


针对中胚层标志物brachyury和MIXL1的特异性抗体被用于免疫染色,并在4°C下孵育过夜。然后,将iPSCs洗涤后与二抗( Donkey anti-Goat AlexaFluor 488 或Donkey anti-Rabbit AlexaFluor 488)和Hoechst 33258孵育,最终在磷酸盐缓冲液中进行成像。


图2. 分化 iPSC 中中胚层标志物的免疫细胞化学。转录因子 Brachyury [绿色,A]、Hoechst 33258 [蓝色,B]、Brachyury 和 Hoechst 的组合 [C] 和转录因子 MIXL1 [绿色,D]、Hoechst33258 [蓝色,E]、MIXL1 和 Hoechst 的组合 [F]。图像是使用 EVOS M5000 获取的(比例尺 = 150 µm)。


03   结论

将 iPSC 分化为中胚层细胞是一个不断发展但前景广阔的领域,具有巨大的治疗潜力。通过利用我们对胚胎发育的理解并改进分化方案,研究人员可以可靠地生成功能性中胚层细胞,用于生物医学应用。


本应用说明中提供的数据表明,使用 Qkine FGF2-G3(Qk053)、Qkine activin A(Qk001) 和 BMP-4 (Qk038) 支持 iPSC 分化为中胚层细胞。


参考文献

[1] Varum, S. et al. Energy Metabolism in Human pluripotent stem cells and their differentiated counterparts. PLoS ONE. 2011;6(6):e20914. doi: 10.1371/journal.pone.0020914

[2] Loh, K. M. et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell, 2016 Jul 14;166(2):451-467. doi: 10.1016/j.cell.2016.06.011

[3] Loh, K. M. et al. Generating Cellular Diversity and Spatial Form: Wnt Signaling and the Evolution of Multicellular Animals. Developmental Cell, 2016 Sep 26;38(6):643-55. doi: 10.1016/j.devcel.2016.08.011.

[4] Lam, A. Q. et al. Rapid and Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Intermediate Mesoderm That Forms Tubules Expressing Kidney Proximal Tubular Markers. Journal of the American Society of Nephrology, 2014 Jun; 25(6): 1211–1225. doi: 10.1681/ASN.2013080831


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