iPSC向三胚层分化系列,将分别介绍诱导多能干细胞(iPSCs)分化为外胚层、中胚层和内胚层谱系过程的Protocol,本期将重点讨论将 iPSC 分化为中胚层细胞的Protocol。
无饲养层人类诱导性多能干细胞 (iPSC) 分化为内胚层细胞是一个复杂的过程,涉及促活素 A、BMP4和FGF2等生长因子。此外,还需要 CHIR99021 和磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3-激酶) 抑制剂 LY294002 等因子来提高分化效率并稳定内胚层命运。这种组合使研究人员能够可靠地生成功能性定形内胚层 (DE) 细胞,用于各种生物医学应用。
在本应用说明中,我们概述了使用含有重组 FGF2 家族成员(如 Qkine FGF2-G3 (Qk053))以及激活素 A (Qk001) 和 BMP-4 (Qk038) 生长因子的培养基将 iPSC 分化为定形内胚层 (DE) 细胞的方法。DE 标记表达用于通过免疫细胞化学评估成功分化。
01 介绍
人类诱导多能干细胞 (iPSC) 是一种体外模型,代表了再生医学和细胞生物学的关键突破。iPSC 是通过引入特定转录因子将成体体细胞重编程为多能状态而产生的。重编程 iPSC 使这些细胞能够分化为三个胚层中的任何细胞类型:外胚层、中胚层和内胚层。这为疾病建模、药物发现和细胞疗法提供了较大潜力,而这些都没有使用胚胎干细胞所带来的伦理问题[1]。
将 iPSC 分化为内胚层谱系细胞尤为重要,因为内胚层衍生物在人体生理学中发挥着重要作用。内胚层形成肝脏、胰腺、肺和胃肠道内壁等重要器官[2]。了解 iPSC 分化为内胚层细胞的过程,为开发多种疾病(包括肝病、糖尿病和囊性纤维化)的治疗方法,以及为研究和移植目的生成类器官提供了希望。
iPSC 分化为内胚层细胞的过程通常涉及在体外模拟胚胎发育阶段。在胚胎发生过程中,内胚层形成由一系列信号通路启动,包括 nodal、Wnt 和 activin/nodal,这些通路对于中内胚层特化和随后的 DE 发育很重要[3,4]。为了在受控的实验室环境中模拟这些条件,研究人员利用特定的生长因子和小分子通过类似的发育信号来引导iPSC。
iPSC 成功分化为内胚层细胞也面临诸多挑战。iPSC 系内的变异性、分化效率以及不完全或混合谱系分化的可能性是研究人员不断克服的较大障碍。评估成功与否需要检查 SRY-box 转录因子 17 (SOX17) 和转录因子 GATA4 等标记物的表达[5]。
02 材料和方法
1.细胞培养和维护
每周使用 0.5 mM EDTA 传代两次 iPSC 以分离,然后以 1:6 的分流比接种在玻璃粘连蛋白vitronectin ( Qkine,Qk120 ) (5 µg/ml) 包被的 6 孔板中,并在 E8 类培养基中培养。传代后的第二天,去除用过的培养基,用 5 ml E8 类培养基替换,使细胞遵循周末无培养基更换模式。使用 Qkine 的耐热 FGF-2 (bFGF) 以及我们的无动物来源 TGF-β1 和玻璃粘连蛋白vitronectin进行weekend-free 的iPSC培养,以提高菌落同质性。
2.iPSC 分化为定形内胚层(DE)
DE 分化工作流程示图(图 1)概述了将 iPSC 分化为 DE 以及通过测试 DE 表达标记来评估分化的步骤。
图1.内胚层分化和评估测试时间表
使用 Accutase 分离 iPSC ,并以 1,000 个细胞/孔的密度接种在涂有 vitronectin ( Qk120 ) (5 µg/ml) 的 96 孔板中,该板中的 E8 类培养基含有 ROCK 抑制剂 (Y-27632, 10 µM)。第二天,即第 1 天,用新鲜制备的 DE 1 培养基喂养细胞(表 1)。第 2 天,用新鲜制备的 DE 2 培养基喂养细胞(表 1),第 3 天,用新鲜制备的 DE 3 培养基喂养细胞(表 1)。
表1.日常DE培养基配制成分,各成分在使用前无菌添加
表2.CDM-PVA培养基配制成分,各成分无菌添加,并在使用前过滤培养基
3.免疫细胞化学
第4天,细胞用4%多聚甲醛固定,随后用稀释在0.1% Triton X-100中的10%驴血清进行封闭和透化。针对内胚层标志物GATA4和SOX17的特异性抗体被用于在4°C下过夜免疫染色。然后将iPSCs(诱导多能干细胞)洗涤,并与二抗( Donkey anti-Goat AlexaFluor 488 或Donkey anti-Rabbit AlexaFluor 488)和Hoechst 33258共同孵育,最后在磷酸盐缓冲液中进行成像。
图2. 分化 iPSC 中内胚层标志物的免疫细胞化学。SRY框转录因子17(SOX17)[绿色,A],Hoechst 33258 [蓝色,B],SOX17和Hoechst结合图像[C],以及转录因子GATA4 [绿色,D],Hoechst 33258 [蓝色,E],GATA4和Hoechst结合图像[F]。这些图像是在10倍放大倍率下,使用Zeiss LSM 980配备的Airyscan2的拼接功能获取的。
03 结论
将 iPSC 分化为 DE 细胞是一个发展迅速且前景广阔的领域,具有巨大的治疗潜力。通过利用我们对胚胎发育的理解并改进分化方案,研究人员可以可靠地生成功能性 DE 细胞,用于各种生物医学应用。
本应用说明中提供的数据表明,使用 Qkine FGF2-G3(Qk053)、Qkine activin A(Qk001) 和 BMP-4 (Qk038) 支持 iPSC 分化为 DE 细胞。
参考文献
[1] Varum, S. et al. Energy Metabolism in Human pluripotent stem cells and their differentiated counterparts. PLoS ONE. 2011;6(6):e20914. doi: 10.1371/journal.pone.0020914
[2] Zorn, A. M. et al. Vertebrate Endoderm Development and Organ Formation. Annual review of cell and development biology 2009:25:221-51. doi: 10.1146/annurev.cellbio.042308.113344
[3] Fang, Y. et al. Metabolic and Epigenetic Regulation of Endoderm Differentiation. Trends in Cell biology 2022 Feb;32(2):151-164. doi: 10.1016/j.tcb.2021.09.002
[4] Ikonomou, L. et al. Derivation of endodermal progenitors from pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 2015 Feb;230(2):246-58 doi: 10.1002/jcp.24771
[5] McLean, A. B. et al. Activin A Efficiently Specifies Definitive Endoderm from Human Embryonic Stem Cells Only When Phosphatidylinositol 3-Kinase Signaling Is Suppressed. Stem Cells. Jan;25(1):29-38. doi: 10.1634/stemcells.2006-0219
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