对单个细胞的RNA进行大规模测序可以揭示不同细胞类型和细胞状态下的基因、异构体以及等位基因的表达模式差异。具有完整转录本覆盖率的基于孔板的单细胞RNA测序方法（SMART-Seq方法）通常在灵敏度方面表现出色，但成本更高且更耗时。瑞典卡罗林斯卡学院的Rickard团队，于2020年5月6日，在smart-seq2的基础上，通过改进开发了smart-seq3技术（Single-cell RNA counting at allele and isoform resolution using Smart-seq3），该技术就是低成本的单细胞全长转录组的解决方案，并将该技术发表在Nature Biotechnology 。

时隔一年，于2021年7月，该团队继续获得研究新突破，在smart-seq3的基础上，对该流程进行mini化和简化，开发smart-seq3xpress方法以降低成本并提高样品处理量。

cDNA合成反应体系

该团队首先探究了反应体系的大小对文库复杂程度的影响，结果如下：

图1

(a)在384孔PCR板的孔中进行纳升级cDNA合成反应示意图（带有3µL overlay）

(b)具体的lysis、RT mixbuffer、PCR mixbuffer在不同反应体系中的具体用量说明。

(c)在HEK293T细胞和K562细胞

(d)相同测序深度下（100K reads），不同反应体系对应检测到的基因数目。P值代表10ul和1ul反应体系之间的t测验结果。

随后，作者探究了低反应体系（Low Volume）中使用不同的overlay（作用：防蒸发）对文库质量的影响，结果如下：

图2 

(e)测试了不同材质的overlay对文库复杂程度的影响，针对小反应体系，不使用overlay会造成文库库容量的严重丢失；

(f)测试了overlay的使用并不会对文库质量产生干扰。

以上数据表明，在可以有效预防蒸发的前提下缩小反应体系（10ul缩小至1ul）并不影响文库数据质量。

标记反应

基于孔板的单细胞转录组测序方法，由于每个细胞均需要单独进行标记（Tagmentation），导致成本增加，方法之一是通过减少Tn5试剂（标记反应所用到的酶）的使用量来降低成本，因此该团队对Tn5试剂的用量以及cDNA用量与文库的复杂性之间的相关性进行探究。实验结果如下：

图3 

(g)input的cDNA容量大小对文库复杂程度的影响（基因数目）；

(h)相同测序深度（reads）下，同一个cDNA产物不同使用量可获得的UMI片段数量 ；

(i)Tn5试剂的用量对文库复杂程度的影响（基因数目）；

(j)相同测序深度（reads）下，不同Tn5试剂用量可获得的UMI片段数量

这些结果表明，标记反应在cDNA输入和Tn5使用量的较大变化中是稳健的，因此可通过减少Tn5用量来节约成本，并且不会影响文库复杂性。

简化流程

在此理论依据基础之上，作者认为可以排除一些耗时且昂贵的实验步骤，包括过度的cDNA预扩增、cDNA纯化步骤（Clean-up）、QC、浓度检测及均一化。对比Smart-seq3，Smart-seq3xpress简化流程请见下图：

图4 Smart-seq3和Smartseq3xpress工作流程的示意图

该团队对cDNA预扩增循环数量以及纯化流程对文库复杂程度的影响进行了探究，实验结果如下：

图5 

(a)一系列cDNA扩增循环数对应可检测到的基因数目（low-volume RT，1ul；HEK293FT cells；n≥8）；

(b)研究了在较低体积中是否可以通过稀释获得的cDNA来替代耗时的cDNA纯化步骤。在相同的测序深度下，通过cDNA稀释和纯化产生的单细胞文库无可检测的差异（t检验，分别为p=0.89和p=0.71）

以上数据表明，减少cDNA扩增循环数以及酶增反应后获得的cDNA产物无需纯化即可直接用于后续的标记反应。

5’ UMI偏好性

Smart-seq3方法获得的库严重偏向于包含UMI的5 '读本，而牺牲了内部（internal）读本，而内部读本对于获得完整的转录组覆盖率至关重要。该研究团队测试了6种不同的商用聚合酶，对后续标记反应的兼容性。测试结果如下：

图6 使用不同的聚合酶进行cDNA扩增，最终测序读取到的5‘ UMI的百分比

使用SeqAmp和PlatinumII扩增的cDNA进行标记反应，后续得到的检测数据显示显著降低了5'UMI读数的比例，降低文库构建的偏好性。

Conclusion

2021年7月，瑞典卡罗林斯卡学院的Rickard团队，研发出Smart-seq3xpress，简化耗时且昂贵的建库步骤，缩小反应体系，降低成本的同时提高样本处理量。

实验数据表明，获得cDNA过程中，在防止蒸发的前提下缩小反应体系至原来的1/10（10ul-1ul），减少cDNA扩增的PCR循环数，扩增时间，去除耗时的cDNA纯化步骤，直接稀释进行后续的标记反应均不会影响后续的文库质量。实验发现，标记反应在cDNA输入和Tn5使用量的较大变化中是稳健的，因此可通过减少Tn5用量来节约成本，并且不会影响文库复杂性。此外，使用特定的聚合酶如SeqAmp和PlatinumII，扩增的cDNA进行标记反应，可降低5'UMI读数的比例，得到更优化的测序数据。

经

过一系列简化实验步骤和缩小昂贵试剂使用量，在不影响文库质量以及测序数据的准确性的前提下，相比较成熟的Smart-seq2技术，在Smart-seq3将成本降低十几倍的基础上，Smart-seq3xpress可以实现成本再次下降3-4倍（图7）

图7 不同建库方法对应的成本

NOTE！！！

实验中低至1ul的反应体系，其中部分组分已达到纳升级，要想实现这么低体积的准确分液同时还要保证高通量，我们的I-DOT-非接触式微量分液系统就要派上用场啦！

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