前言

现如今细胞治疗因为相较于传统药物的独特的靶向性作用机制和长期的疗效体现成为新药研发的热点，随着越来越多的细胞疗法进入临床应用，对高质量、兼容不同细胞类型、稳定供应的细胞培养基补充剂的需求越来越大。人血小板裂解液(hPL)是几种可用于临床和商业化生产制造细胞治疗产品的补充剂之一。hPL来源于混合人的血小板裂解物，与含有在胎牛血清(FBS)和人AB血清中相同的生长因子和细胞因子相当的水平。

美国Sexton品牌的hPL系列产品，左边为PR工艺的nLiven

E-beam原理以及和传统辐照的区别

一般而言hPL的制作原材料血小板相关的筛查和测试标准是与输血前血液筛查相同，以此将hPL原材料安全风险控制在较低的水平。但我们知道传染性病原体(特别是人类病毒)的传播仍然是人类血小板衍生产品(如hPL)的一个考虑因素，且多个捐赠者的混合血小板裂解液可以提高hPL批间一致性和性能，但同时增加了病毒污染的风险。

对于这些的病毒处理，电子束和伽玛辐射都具有相同的电离辐射对核酸的损伤机制，常用于医疗和食品的辐照。有研究表明，伽玛照射能有效地灭活病毒，但不可避免的带来些许生长因子的丧失，不良的产物特性(浑浊现象)，以及细胞扩增水平的整体降低。因此通常还需要额外的步骤，如添加蛋白质稳定剂，以对抗这些影响，但这些步骤需要额外的表征，从而会引入了新的风险问题。

图1 Sexton品牌病原体减少PR工艺设计流程

与传统的伽玛辐射方式不同，美国Sexton公司生产了一种pathogen-reduced病原体减少的hPL (PR hPL)，采用电子束照射(E-beam)的过程来降低病毒传播的风险。如图1所示E-beam主要通过电离辐射的原理，通过电子束直接作用，以及电子束激发水分子产生羟基自由基、还原性水合电子等活性粒子的氧化-还原的间接作用，对包括病毒等微生物体内的DNA或RNA分子以及蛋白质包膜产生破坏，进而达到病毒减少工艺的作用效果。

美国Sexton PR系列产品是依照国际人用药品注册技术协调会ICH/295/95和世卫组织WHO相关附件被用作设计病毒清除验证的指南，建立待验证工艺的缩小模型，将工厂生产的nLiven PR，运送到测试实验室，在待验证样品中人为地加入一定种类和数量的病毒（针对血浆来源常规的代表性模型病毒）。然后产品进行病毒去除/灭活工艺步骤，处理，并返回到测试实验室进行病毒减少验证分析。

图2 Sexton品牌病原体减少PR工艺设计流程

今天小编将介绍这种病原体减少工艺制作的PR hPL，主要分别进行生长因子水平和病毒测试(流程见图2：左图是E-beam处理hPL后的生长因子分析和细胞扩增实验，右图是E-beam处理hPL后的病毒分析），演示了PR工艺可以实现在不显著影响hPL组成和hPL功能的情况下实现病原体减少作为良好的细胞培养补充物性能。

实验部分

1、细胞因子水平验证

图3 PR工艺的hPL中FGF/EGF/PDGF-AB/ TGF-β/ PDGF-BB水平比较

使用ELISA 等方法对于伽玛辐射的普通hPL（（蓝色））和电子束的nLiven（红色）针对以下的常见hPL中的细胞因子分别进行3组重复分析求取平均值，该实验中发现除了3A图中的成纤维细胞生长因子（FGF）水平，其他细胞因子如3B图中的内皮生长因子(EGF)、3C图中的血小板衍生生长因子AB (PDGF-AB)、3D图中的组织生长因子β (TGF-β)以及3E中的血小板衍生生长因子BB (PDGF-BB)在通过电子束照射(E-beam)的PR工艺获得的hPL中含量是相对偏高的。

接着实验人员以骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSCs)培养实验为例来验证PR工艺hPL的产品性能。

2、细胞扩增生长验证

图4 PR工艺的hPL与其他补充剂的细胞扩增数目与形态比较

将BM-MSCs以20000个细胞/孔的比例接种在12孔板中。细胞培养4到5天，收获后使用细胞活力分析仪进行总细胞计数。分别比较在含有hPL、PR hPL和γ -辐照FBS的培养基中培养的骨髓间充质干细胞BM-MSC的细胞增殖率。在三组培养基补充剂培养条件下的BM-MSC相对细胞扩增数比较结果中（图4左），我们可以看出该实验中美国Sexton品牌的stemulate和PR工艺的nLiven产品相对于γ辐照的FBS组获得很多的细胞扩增数目，在显微镜下观察获得的三组培养基补充剂培养条件下的BM-MSC细胞形态比较（图4左）Sexton品牌的两款hPL相对于辐照的FBS细胞生长更为致密和均一。

3、病原体减少工艺的验证

使用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)进行标准病毒空斑试验评估生产工艺去除和/或灭活病毒的能力，在小规模的生产工艺中进行相关病原体减少/去除效果的验证。主要在应用电子束处理病原体步骤之前，将BVDV刺突病毒引入样品，然后对经电子束处理的样本进行残留病毒分析。如上图表2中所示PR 工艺的hPL的显示模型包膜病毒BVDV减少了6个对数值。

4、其他PR工艺的hPL生化指标

图5 PR工艺的hPL关于渗透压（Osmolality）、pH以及总蛋白的批间一致性数据展示

图5种显示美国Sexton品牌的nLiven血小板裂解液池使用E-Beam进行病原体处理的产品关于渗透压（Osmolality）、pH以及总蛋白的32个批次的一致性数据展示，可见CV值小于10%。

结论

通过以上对比我们可以发现在Stemulate或nLiven中生长的骨髓间充质干细胞BM-MSC始终显示出强劲的细胞扩张，以nLiven培养性能相对更明显，而在辐射胎牛血清中生长缓慢得多。类似的结果我们在其他来源的干细胞扩增实验中也得到了证实，对项目扩增有特殊更高要求的客户可以考虑从传统的hPL过渡到PR工艺的hPL（nLiven）版本。Sexton Biotechnologies的nLiven PR是一种经过验证的、强大的病原体减少工艺，为细胞培养提供一致的、高质量的培养基补充。

与nLiven不同的是Sexton公司另外一款T-Liven PR是PR处理的血小板裂解液的封闭袋装系统版本，该产品涉及一系列包括t细胞生长验证试验的放行测试，确保免疫细胞培养过程中的细胞质量。

并且有趣的是，尽管T-Liven PR中在被应用于T细胞等免疫细胞相关治疗时，对于CAR转导细胞的表型也被发现具有显著的优势。(Torres-Chavez等人2019年，请联系曼博生物获取相关文献资料)

图6 Sexton品牌的T-Liven PR产品