引文

在干细胞治疗领域中，来自中胚层且具备自我更新及多项分化潜能的间充质干细胞已经在临床应用上表现出巨大的潜力（文献参考1），人(hMSCs)是目前正在进行的多种适应症的临床试验的重点（文献参考2），对于大多数这些临床适应症，需要体外扩增培养细胞提供有效足够的治疗剂量。因而建立合适的体外hMSCs培养扩增体系，实现大规模体外培养扩增高质量的MSCs不仅有利于其功能分化研究，也是MSCs临床应用以及规模化商业化生产的关键。

MSCs体外扩增生产工艺开发的关键因素除了培养基以及培养基补充剂等（关联阅读：人血小板裂解物（hPL）系列分享一），培养方式包括扩增技术和培养规模也格外重要。目前MSCs可以2D单层平面培养（最常见的培养瓶或者培养皿），也可以附着在微载体上进行3D培养，微载体的应用增加了细胞生长的可用表面积。将微载体与适当的生物反应器结合，可大大增强的细胞收获能力，减少操作步骤。

小编主要分享的是：通过使用添加了人血小板裂解物（hPL）的无外源动物成份MSCs生长培养基，成功的在微载体与生物反应器的3D培养环境中扩增人骨髓来源间充质干细胞(hBM-MSC)。

2D培养环境中微载体筛选

为了确定合适的微载体体系，实验人员在微孔板的2D环境中（Corning 6孔超低吸附板）筛选了几种市面上可用的微载体Plastic, Plastic Plus, Pronectin F, and Star Plus (Pall, USA)。每个微载体做三个复孔，培养的三天中每天消化每种微载体的一个孔的细胞进行处理和计数。

图1 2D环境中微载体筛选

最终发现如图1所示，在小规模的2D环境的微载体筛选实验发现Plastic,和Pronectin F这两种微载体相关培养体系中hBM-MSCs细胞具有相对较高的生长能力。

小规模3D培养比较

基于上述2D筛选实验中选择的两个性能不错的微载体Plastic和Pronectin F，在100 mL带立式旋转轮的培养瓶中进行小型3D实验。用16g/L无菌微载体在100mL 3D培养瓶中以20rpm培养hBM-MSCs 9天，第4天和第7天更换培养基。定时取5ml样品统计细胞生长曲线（图2a）。

图2 两种微载体在小型3D培养体系中的细胞生长情况

通过将Plastic和Pronectin F在100mL 3D立式旋转轮培养瓶体系的比较，最终发现如图2所示：不管是细胞生长曲线还是3轮培养中平均细胞收获能力（细胞生长密度）Pronectin F都表现最佳，该微载体3D培养体系中hBM-MSCs细胞有相对较高的生长能力，因此选择Pronectin F进行下一轮的种子细胞培养试验的候选微载体。

种子培养实验

图3 种子培养实验流程

低温保存的hBM-MSCs在T225培养瓶中复苏扩增，然后收集10M细胞接种到500mL立式旋转轮培养瓶中，添加Pronectin F微载体16g/L，以18 rpm培养细胞6-7天（第4天更换培养基）。然后继续将收获大约55-60M的细胞转移到3L生物反应器系统中，添加16g/L的Pronectin F微载体继续细胞培养11-12天（第4天和第7天更换培养基）。培养期间分别采集0.5L和3L的细胞，流式细胞仪（FACS）分析细胞表面标志物CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和HLA-DR的表达情况，并且收集的细胞在成脂分化培养基(Lonza，美国)中培养10天，并用Oil Red O (Sigma，美国)染色检测其分化能力，另外细胞接种到3L生物反应器中后每3天取样Calcein AM染色在显微镜下观察细胞生长状况。

表1：FACS检测0.5L和3L体系扩增后细胞表面抗原特性

表1中FACS分析结果表明，两种3D培养体系中的MSCs均一表达了CD73和CD90，而CD34、CD45和HLA-DR等为阴性。图4显示从0.5L和3L生物反应器中获得的细胞在分化培养基中培养10天后都出现油红O染红的脂滴。

图4：a) 0.5L和b) 3L细胞在20X显微成像观察其成脂分化。

通过荧光显微镜观察生物反应器中微载体表面细胞贴附生长情况，如图5中显示：接种后细胞从最开始贴附微载体表面呈半球形后慢慢开始舒展至最后长满微载体表面。

图5 3L生物反应器中显微镜下观察细胞生长状况

总的来说，种子培养实验通过先在T225中扩增数百万个hBM-MSCs细胞，将它们转移到500mL的带有Pronectin F微载体的3D培养体系中获得了6倍扩增，然后再将细胞转移到3L带立式旋转轮生物反应器系统中进行进一步的13倍扩增，最终获得了一个种子细胞组。本实验人员在经过两次微载体3D环境体系培养后，将hBM-MSCs体外扩增培养实现了82倍的放大效果，并且整个扩增过程中MSCs维持表型以及对应分化能力。

因此可知微载体结合生物反应器3D培养体系是一种可行的体外MSCs扩增技术，再结合优化的培养条件（细胞接种密度、转速、溶氧等）可为临床应用提供足够量的种子细胞，最终满足MSCs临床应用的需求。

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兼容性：作为培养基补充剂，替代胎牛血清FBS或AB血清，适用于广泛的细胞类型包括MSCs, T细胞，NK细胞，内皮细胞等的培养。

安全性：在ISO9001认证的设施中验证了病原体的减少，并进行了无菌，支原体和内毒素等测试

重现性：通过汇集来自AABB认证/FDA注册血液中心的100多名美国人体捐献者，最大限度地减少了批与批之间的差异

可靠性：AABB认证/FDA注册官方认证血源

合规性：在欧洲药典5.2.12.4章则要求的环境下生产，在FDA 已进行BMF备案

无需肝素：产品生产过程和使用过程都无需添加肝素

易于使用：直接按比例添加入培养基，可选规格100ml和500ml

稳定供应：上海曼博生物作为美国Sexton品牌hPL产品在中国的一级代理商，为细胞治疗企业提供国内细胞治疗企业需要的长期现货的hPL，为临床以及大规模商业化生产保驾护航.

图1 适用于MSCs培养的Stemulate

图2 适用于T/NK免疫细胞等难培养细胞的nLiven PR

图3 适用于临床商业化生产过程中无缝衔接的袋装系统的T-Liven PR