总部设在芬兰奥卢的器官芯片制造商 AKITA,by Finnfadvance ,成立于2019年。搭载拥有高通量器官芯片板,可被设计成单器官和多器官,兼容几乎各成像模式,高人体相关性的下一代人体体外模型,加速药物开发,降低临床前试验失败的风险,也可用于个性化医疗。上海曼博生物医药科技有限公司是AKITA,by Finnfadvance授权的中国经销商。
AKITA背景介绍
早期研究中的传统体外方法在评估人体药物或疗法时提供的结果可靠性较差。这些方法使用传统的2D细胞培养在塑料或玻璃基质上,部分复制了应用于组织的复杂细胞外基质和机械力(Yuste等,2021)。
细胞需要特定的微生理条件和刺激才能像体内那样发挥作用。AKITA Plate被设计为以可扩展的方式重现组织和生物界面的微生理条件。微流控的使用使得双向液流增强了生物屏障的完整性和组织成熟。无管道且用户友好的AKITA Plates也被设计为与当前的体外骨骼架联合使用。
近年来,各界对3D细胞培养和微生理系统的兴趣日益增加,主要集中在模拟软组织,导致了对结缔组织更好的体外表征的进展有限,包括骨结构,尤.其是骨的钙化部分。
Ossiform专门生产由人类钙化骨中发现的主要矿物质B-三钙磷酸盐组成的生物陶瓷。他们的技术目前被用于体外和体内的骨和骨疾病研究,为研究者提供了一个可靠且可重复的模型系统。
尽管Ossiform的生物陶瓷被细胞和哺乳动物认为是真正的骨骼,但人们依然希望有一个体外骨模型,它也能模拟体内发现的动态营养流和氧气传输。
通过将AKITA Plate的微流控特性与Ossiform的生物陶瓷支架相结合,骨和骨疾病的研究者们得到了一个生理相关且受控的环境,用于研究组织再生,这最.终可以开发新的和改进的骨疾病治疗方法。
材料与方法
01 细胞培养
人骨骨肉瘤上皮细胞 (U2OS细胞) 在Dulbecco’s Essential Medium Eagle medium (Sigma-Aldrich) 中培养,该培养基补充了1%的MEM非必需氨基酸 (Sigma-Aldrich) 、1mm的L-谷氨酰胺 (Sigma-Aldrich) 、1%的青霉素-链霉素 (Gibco) 和10%的胎牛血清 (FBS, Serana) 。对于传代,使用了0.25%的胰酶-EDTA (Gibco) 。只有传代数在10以下的细胞被用于这项研究。
人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 在Endothelial Cell Growth Medium 2 (Promocell) 中培养,该培养基补充了10%的热灭活FBS和1%的青霉素-链霉素 (Gibco) 。对于传代,使用了0.05%的胰酶-EDTA (Gibco) 。传代数在6以下的细胞被用于这项研究。
02 AKITA Bone-on-chip平台
对于类骨培养,使用了微流控AKITA Plate (Finnadvance) 和多孔3D打印骨支架 (P3D Scaffolds, Ossiform) 组合。优化的AKITA Plate,384孔板格式,包含96个独立的测试单元,在这些单元中,支架在动态液流下培养(图1)。
AKITA bone-on-chip平台经过专有表面涂层处理,以防止细胞附着到微通道,并允许细胞特异性地附着到正在测试的生物支架上。
图1:AKITA微流控板设计
03 骨支架涂层和细胞接种
多孔3D打印骨支架 (P3D支架,Ossiform) 被用来实现类似体内的3D细胞培养环境。这些支架是由B-三钙磷酸盐制造的,也是骨骼的主要成分。为了测试涂层对细胞附着和生存能力的影响,支架在转移到AKITA Plate之前,要么涂有100ng/ml纤维连接蛋白 (PromoCell) 并在37°C下孵育4小时,要么不涂层。无支架的AKITA Plate测试孔被用作对照。各条件的实验均有4个技术重复。
04 细胞活性读出
为了测量细胞的生长和活性,使用了Cell Counting Kit-8 (CCK-8,Sigma-Aldrich) 。根据制造商的指示,在细胞播种后的第1、3和6天进行了活性测定。简单来说,丢弃培养基,并用1:10比例的CCK-8溶液:培养基替换。孵育4小时后,从支架顶部收集10微升的样品,并在标准的384孔板中用5微升的PBS稀释。使用微孔板读数器测量450nm的吸光度。
实验结果
01 AKITA Plates被用来通过测量细胞活性,来监测细胞在3D骨支架中的植入和生长
因为Ossiform支架的组成接近骨的细胞外基质,我们期望它能促进骨系U2OS细胞的植入。我们还研究了涂层和液流对实验结果的影响。
U2OS细胞在无涂层和纤维连接蛋白涂层的支架中都显示出强大的植入能力,通过维持6天的培养期的活性 (图2) 。
在无涂层的支架中,细胞的活性被维持,而纤维连接蛋白涂层在实验时间范围内提高了细胞增殖。我们观察到,纤维连接蛋白涂层中的细胞生长被液流增强 (图2,右侧) 。
图2:在AKITA Plate中培养的Ossiform骨支架中的U2OS细胞活性
U2OS骨系细胞在静态和动态液流条件下都能在无涂层的骨支架上保持活性 (左) 。纤维连接蛋白对支架的涂层在动态液流下增强了6天培养期间的细胞活性 (右) 。数据显示为平均值±标准偏差,n=4。
02 为研究非骨系列细胞是否也会在Ossiform,支架中植入,我们测试了人脐静脉内皮细胞HUVECs
血管细胞在支架中的植入效果较差,随着时间的推移,细胞数量减少 (图3) 。纤维连接蛋白涂层仅在液流条件下缓解了这种效应,而在静态培养中未观察到明显差异。
重要的是,液流冲走了种植在骨支架外部的细胞,这使得我们能够特别研究植入的细胞群体,并减少了背景噪声。实际上,与静态条件相比,液流几乎消除了无支架控制液流中的细胞活性信号 (图3) 。
我们还观察到,液流减少了标准偏差,从而提高了结果的重复性 (图3) 。这证实了动态液流改善了信噪比以及重复性,从而提供了更高质量的数据。此外,它表明AKITA bone-on-chip平台特别促进了骨系列细胞的生长,因此它模拟了临床相关的特征。
图3:在AKITA Plate中培养的Ossiform骨支架中的HUVEC细胞活性
HUVECs在骨支架上的活性随时间的推移而减少,无论是无涂层 (左侧) 还是纤维连接蛋白涂层 (右侧) 。
液流降低了无支架控制条件下的活性信号,这表明液流对于消除源自骨支架外部生长的细胞产生的任何背景噪声是重要的。数据显示为平均值±标准偏差,n=4。
结论
AKITA Plate的骨芯片显示,与非骨细胞系 (Huvec) 相比,U2OS成骨细胞优先植入。由于其动态液流,AKITA Plate上的骨芯片提高了细胞活性信号/噪声比和可重复性。
因此,它允许生成高质量数据,用于高通量评估骨修复。这种用户友好型模型可靠地用于基础研究、药物筛选和个性化医学。
参考文献
Yuste I et. Al. Pharmacological research 169, (2021). DOI 10.1016/j.phrs.2021.105626