前言

外周血干细胞(PBSC)已成为自体造血移植首选的干细胞来源，大量报道表明自体干细胞移植后比较重要的移植预测因子是CD34⁺细胞剂量。因此PBSC单采的一个主要目标是收集足够数量的CD34⁺细胞，以支持高剂量治疗后的快速造血重建，目前可接受的剂量为2-5 × 10⁶个细胞/kg。为了达到CD34⁺细胞的这一剂量目标，通常需要进行多次单采，而为了在采单和高剂量调理治疗之间的长时间间隔内保持干细胞/祖细胞的活性， PBSC产品进行冻存是关键步骤。

典型的低温冻存/复苏技术会导致细胞大量丢失以及快速移植所需的关键CD34⁺细胞的活力/功能降低。目前没有通用的冷冻保存方案被普遍使用，不同移植中心之间存在显著差异。特别的是他们所用冻存液配方的差异可能导致解冻后细胞存活能力的不同水平以及显著的总细胞和最重要的CD34⁺存活细胞的损失。因此需要探索PBSC超低温冻存的新方法，重点是改善冻存后干细胞的恢复和功能。

01 实验详细

本研究中研究者们基于外周血干细胞PBSC的冻存将CryoStor(BioLife Solutions, Inc.)与弗雷德·哈钦森癌症研究中心(FHCRC)使用的标准冻存液配方进行比较。旨在探讨BioLife这种含胞内冷冻保护剂的冻存液(CryoStor)是否可用于PBSC的超低温冻存，以及与 FHCRC 标准临床应用的冷冻介质相比，CryoStor冷冻保存能否提高干细胞的体外产量和功能。

主要方法是通过将采集人PBSC单采标本，处理成5 × 10⁷细胞/ 1ml放置在冻存管中然后在以下两种冻存液中保存：

1) FHCRC标准冻存液，含Normosol-R, 5% HSA, 10% DMSO；

2) CryoStor CS10(最终稀释 5% DMSO)

冻存过程涉及一个标准的程序降温冷冻程序后将冻存管保存在气相液氮冷冻室至少一周，然后取出复苏后对样品进行总有核细胞计数(TNC)、存活率、CD34⁺百分比、爆发形成单位(BFU)和集落形成活性(CFU)等。

02 PBSC 冻存结果对比

图1- BioLife 两款冻存液CS10和CS5关于PBSC冻存数据对比

比较 CS5和 CS10与 FHCRC 标准方法作为一种手段，以确定哪种冻存液对PBSC更有效。共收集了9个样本并进行了比较评价。并根据 TNC、 BFU、 CD34⁺细胞和 CFU 对冷冻保存的样品进行比较。

在初步研究的基础上发现与 CS5相比CS10在解冻后的每个测试参数中都获得了更有利的结果(图1)。平均而言，CS10的TNC 回收率比 CS5高1.2倍，而CS10的 BFU，CD34和 CFU 回收率比 CS5高1.35倍(图1)。基于该结果CS10被用于研究的接下来的部分，并与 FHCRC 标准冻存液进行PBSC冻存性能进行比较。

CryoStor显著提高CD34⁺细胞的存活率

与 FHCRC 标准相比，使用 CS10冷冻保存 PBSC 样品导致所有9个样品中活性 CD34⁺ 细胞的解冻后恢复得到改善(图2)。平均而言，CS10相对FHCRC 标准组增加了1.68倍，且具有统计学显着的 p 值 = 0.005 (图5;表1)。

图2- 用CryoStor或FHCRC标准冷冻保存后，活CD34祖细胞的解冻后恢复对比

CryoStor显著提高了解冻后CFU的回收率

9个样品中的7组呈现在 CS10冷冻保存的样品解冻后观察到更多的 CFU 集落(图3)。CS10相对于FHCRC标准组CFU 平均增加1.5倍，且具有统计学显着性p 值 = 0.030(图5; 表1)。

图3- 采用CryoStor或FHCRC标准进行低温保存后的融后菌落形成单元CFU对比

CryoStor显著提高了解冻后粒细胞的恢复

在对PBSC进行低温保存后，使用CS10也显著提高了9组样本中8组的总体粒细胞回收率(图4)。与FHCRC标准相比CS10的粒细胞回收率平均高出2.3倍，且具有统计学显着性p值= 0.045(图5;表1)。

图4- 用CryoStor或FHCRC标准冷冻保存后的粒细胞解冻后恢复对比

与FHCRC标准相比，CS10组所有对比参数的平均优化倍数提高

同样的在9组PBSC样本测试中，FHCRC标准组与CS10的TNC、总CD34⁺、活CD34⁺、CFU和BFU以及粒细胞恢复的倍数比较。如图4呈现的每个参数观察到的平均倍增显示：两种低温保存方案的TNC回收率基本相同，CS10可使BFU细胞恢复增加1.24倍，但此差异无统计学意义(p值= 0.1195;图5;表1)。不过使用CS10后所有其他参数包括CD34⁺、CFU-GM和活粒细胞回收率均显著提高。

图5- PBSC的低温保存：CryoStor与FHCRC标准方法的比较

表1- 解冻后两组冻存液的统计分析数据

03 结果讨论

本次研究使用一种新的细胞内类冷冻保存溶液(CryoStor)与含有5% HSA和10% DMSO的标准FHCRC配方在用于PBSC的冷冻保存进行了比较。结果表明与FHCRC标准应用溶液相比，CryoStor CS10提供了一种最终DMSO浓度为5%的无蛋白和无血清冻存溶液方案，在解冻后对活CD34⁺细胞、CFU-GM和粒细胞的回收率均带来显著提高。目前CryoStor已被证明可以增强多种细胞和组织类型的冷冻保存和解冻后恢复，包括但不限于脐带血、树突状细胞、PBMC、肝细胞、神经元细胞、干细胞、t细胞和工程组织。此外值得注意的是CryoStor与细胞悬液1:1稀释(与标准FHCRC方法相匹配)，从而将载体溶液中的关键成分与DMSO一起减少了一半。

CryoStor解决方案为PBSC的冻存提供了一种增强的方法，可以产生显著改善了PBSC中干细胞/祖细胞的恢复，该冻存液带来的细胞回收率提高和功能恢复并不引入任何额外的血清或血清衍生蛋白，最后减少一半的DMSO浓度/体积也降低了输液毒性的发生率和严重程度。因此我们可知使用CryoStor进行超低温冻存可能最终能改善了PBSC中CD34+细胞含量较低的患者的移植收集，同时减少额外的单采收集的需求并降低与DMSO高暴露相关的不良输注反应的风险。

图6- BioLife Solutions各种包装规格冻存液产品