摘要

T细胞治疗制剂的开发具备一定的挑战性，最终制剂冻存更是关键，尤其是制剂工艺完成的最后一步的灌装期间的保持时间和解冻复苏后至CART细胞病人给药的保持时间的优化。在本篇研究中研究者们利用Pan T细胞模型，通过冻存液以及最终冻存组合制剂筛选实验确定了CAR-T细胞冷冻保存培养基的优化配方。主要通过将BioLife Solutions的CryoStor超低温冻存方案组合与含有HSA以及高浓度DMSO的实验室自制冻存液制剂相比，评估Pan T细胞解冻后是否有更高的细胞活力和活细胞密度(VCD)，主要在解冻复苏后立即和重悬3天里测量细胞活力和VCD，以确定冷冻保存介质对细胞恢复的影响。基于Pan T细胞筛选的实验结果以及冻存方案组合在CAR-T细胞中直接进行评估，最终研究结果证实了BioLife Solutions提供的一种良好的T细胞制剂冻存方案。

基于Pan-T细胞模型的冻存方案筛选

01 冻存液的筛选

· 商品化即用型CryoStor10冻存液组：冻存液是10% DMSO，细胞最终制剂中DMSO终浓度为5%。

· 实验室自制冻存液组：含8%HSA和15%DMSO的生理盐水，最终DMSO浓度为7.5%；

各组细胞均悬浮于生理盐水中配置成50*106个细胞/ml的最终T细胞冻存悬液制剂。

图1 细胞制剂和复苏恢复流程

图2 解冻后恢复3天内各组平均活细胞密度 - 7.5% DMSO组 vs CS10组

冻存液对比实验结果：使用CryoStor10 (CS10)冻存的细胞比在实验室自制冻存液的组获得的细胞恢复得更好（VCD更高）。

02 最终T细胞冻存悬液组合筛选

进一步研究在Cryostor Basal(CSB)冻存液中采收细胞去制成最终T细胞冻存悬液制剂是否会比生理盐水方案提供额外的冷冻保存效果。

· CryoStor10 (CS10)+盐水组合

· CryoStor10 (CS10)+Cryostor Basal(CSB)组合

如上各组细胞悬浮于生理盐水及CSB冻存液中配制成50*106个细胞/ml。

图3 解冻复苏后保留3天时间平均活细胞密度 - 生理盐水采收组 vs CSB组

T细胞最终细胞冻存悬液组合的对比实验结果：与生理盐水组相比，Cryostor CSB组合CS10可以提供更好的冷冻保存效果。

T细胞制剂冻存的稳定性放大验证

将细胞以50*106个细胞/ml的速度灌装填入1.8 ml的冻存管中（经历室温放置3个小时），细胞分别经历120分钟和180分钟预冷冻后在液氮罐中稳定保存3个月。

表 本研究中测试涉及的实验室组合

3个月后37°C水浴解冻后分别将细胞在4°C、22°C和37°C下保存2小时，然后对解冻后恢复的3天内测定细胞活力和VCD。

图4 与BioLife Solutions商品化的冻存方案相比，实验室自制冻存液组合组在37°C时的各组整体活力有所下降

基于CAR-T细胞的冻存方案验证

01 冻存液的筛选

CAR阳性T细胞分别在实验室自制冻存液以及CS10中配制，以生理盐水为悬浮溶剂，配制成50*106个细胞/ml，灌装在2ml冻存管中。细胞制剂灌装完成前保留120分钟，然后预冷冻120分钟，测试解冻后细胞解冻后2天内的活力恢复数据。

图5 CAR-T细胞解冻后的平均活率

02 CAR-T细胞最终冻存悬液

CAR-T细胞的冻存液组合也是CS10与CSB组合作为最终冻存悬液，并与在相同冻存配方配置的Pan T细胞进行冻存效果比较。

图6 解冻后CAR-T细胞与Pan-T细胞的平均存活率对比

实验结论

01-本研究首先基于Pan T细胞的冻存液及最终冻存悬液组合筛选实验中可以观察实验室自制冻存液与BioLife Solutions商品化冻存液的明显差异。在CryoStor 10中配制的Pan T细胞在3天内的细胞要比在实验室自制配方中配制的细胞恢复得更好，并且将细胞悬浮在CSB中而不是生理盐水中可能对于改善冷冻保存后的恢复也有一定的帮助。

02-在Pan T细胞模型的大规模配方制剂冻存的稳定性研究证实，实验室自制配方的性能相比BioLife Solutions商品化的配方差，解冻后保存在4°C和22°C下的结果差异不大，但解冻后在37°C保存时，实验室自制配方的活力和VCD下降。可以知道BioLife Solutions商品化的冻存液配方相比实验室自制冻存方案更有利于细胞制剂复苏后37℃的活力维持，确保后续细胞制剂的治疗功能维持。

03-基于CAR-T细胞的冻存实验中，CAR-T细胞组与Pan T细胞数据相比，CS10与CSB冻存组合的性能在这两种细胞上没有显著差异，而且Pan T细胞的一些含盐水的最终冻存悬液制剂中观察到结块，这表明CSB相对盐溶液可能更适合作为T细胞制剂的冻存重悬基质的最终冻存制剂。

图-BioLife Solutions商品化无DMSO的CSB冻存液