前言

细胞存储是细胞治疗行业供应链的一个重要组成部分，生物保存是指支持生物细胞稳定性以确保保存后功能恢复的过程。传统上是通过将温度降低到刚好高于水的冰点(2-8°C)来减缓细胞代谢，或者通过将细胞冷冻到低温(如液氮，-196°C)来在假死状态下阻止所有生物活动来实现的。然而在这两种情况下冷诱导的生理和生理应激可累积到一定程度，使细胞损伤超过修复能力，引发下游凋亡和继发性坏死细胞死亡途径。优化的生物保存策略可以减少这种冷诱导的应激，并可以改善细胞的健康和功能。

在开发商业化商业模式时，需要考虑到新鲜制剂和冷冻制剂的特定优势和注意事项。

如图1所示：

供应链有两种主要模型:

1）场景1：往目的地冷冻运输，复苏使用；

2）场景：开发新鲜(非冷冻)制剂运输。

在场景1的冷冻运输模型中。患者/供体细胞通常在诊所收集，并在低温或低温状态下运送到现场或非现场实验室/设施，进行进一步处理和培养。在回程时治疗性自体/同种异体剂量被冷冻保存并运送给患者，在那里进行解冻、处理和给药。在新鲜输送模型中，细胞在中央制造设施配制，并以新鲜的液体形式运输到PoC （医院或者护理中心）。因此可知冷冻制剂模式需要训练有素的医护人员和医院PoC的适当设备配置，而新鲜交付模式则减少了这种需求。但新鲜细胞制剂由于保质期的限制，需要更快的交货时间和更严格的物流控制，保持有限交货时间内细胞产品的稳定性。

图1 细胞治疗制剂的两种应用场景：冻存制剂VS新鲜制剂

许多报道表明，与室温储存相比冷藏低温储存（2-8℃）可以促进多种细胞类型(包括干细胞)的整体恢复和稳定性，然而当细胞低温储存超过24小时后，通常会发生明显的活力和功能恢复丧失。因此延长低温存储的稳定性对于用于下游加工或患者应用的细胞制剂产品是有益的。本案例研究中，研究者们为了强调了在储存和运输过程中使用适当的生物保存溶液来保持细胞活力和功能的重要性，使用人间充质干细胞（hMSCs）代表模型系统研究了短期2-8℃低温储存下不同储存介质和低温保存方案的效果-对MSC活力和恢复的影响。

hMSCs的2-8℃低温存储

实验材料和方法

细胞培养：人间充质干细胞(hMSCs)在烧瓶中培养至约95%的融合度下，每5-6天进行传代培养，每3天补充培养基，实验用的细胞培养一般处于P2和P10之间。实验前在培养液中添加新鲜培养基1天，根据制造商说明书进行hMSCs向成骨细胞的分化。成骨细胞分化后，将成骨细胞置于hMSC成骨分化培养基中。

2-8度低温存储：测试了不同生物保存溶液的低温贮藏效果。

1）含胞外存储保护剂的保存液测试组:MSC基础培养基(添加10%血清)、Normosol-R和PlasmaLyte A、AQIX (AQIX Ltd, UK)和Celsior (Genzyme, MA, USA)；

2）含胞内存储保护剂的保存液测试组:测试了ViaSpan (Barr Pharmaceuticals)和HypoThermosol FRS(BioLife Solutions)。

在该低温储存实验中，细胞被种在96孔培养板中，培养104个细胞/孔。此时将培养基更换为相应的低温存储保存液(100 μl/孔)，用副膜密封2-8℃保存1-7天。低温保存后，将培养皿从低温中取出，将生物保存液替换为添加血清的MSCs培养基GM，细胞在培养条件下恢复1天然后进行评估。

实验结果

图2 为了比较不同储存介质对低温储存后hMSC恢复的效果

FRS(HTS-FRS)(A)、ViaSpan(B)、Normosol-R(C)和Plasma-Lyte (D)等

图2中是MSCs分别保存在四组低温贮藏剂中在低温贮藏1天(第1行)和3天(第2行)后的形态学结果显示。图中第三行是通过荧光显微镜下F-actin (Alexa Fluor 488 phalloidin)染色;绿色)和核(Hoechst 33342;蓝色)在低温储存3天后的形态展示。

低温储存1天后，储存在ViaSpan、Normosol-R和Plasma-Lyte A中的hMSCs细胞，MitoTracker Red荧光普遍下降，这表明线粒体功能减弱，与细胞活力下降一致(图2)。含胞外存储保护剂的保存液配方组的线粒体形态从网状到碎片化网络的显著改变，而在ViaSpan中储存的hMSCs中MitoTracker红色荧光减少，但低温储存对线粒体形态没有显著影响，这表明含胞内存储保护剂组更好地保护了低温损伤存活细胞的线粒体功能。尤其是低温储存在HTS-FRS组如上图中显示的强大的MitoTracker Red染色和更正常的线粒体形态，可知美国BioLife公司的HTS-FRS中对hMSCs具有保护作用。

在低温条件下储存3天后，HTS-FRS中储存的hMSCs显示出完整的肌动蛋白细胞骨架，并保持了视觉上完整的细胞单层(图2)。相比之下，hMSC细胞在其他低温存储介质中仅1天后就显示出细胞数量减少且细胞表现出异常形态，这表明可能存在的肌动蛋白细胞骨架受损。在低温保存3天后只有保存在HTS-FRS中的细胞在染色后显示出与未保存前的对照组相似的正常肌动蛋白细胞骨架。尽管ViaSpan、NormoSol-R和PlasmaLyte-A组存在明显的细胞损失，但所有组的细胞储存后分化表现出相似的分化能力(图2a3 - d3)。

除形态学检测外，在细胞返回培养条件24小时后，还使用代谢指标alamarBlue检测hMSCs的活力恢复情况。结果与显微镜下的形态一致：保存在HTS-FRS中的细胞与其他细胞组相比，保存后的功能恢复得到了改善(图2)。与未保存的对照相比，HTS-FRS中保存1天的hMSCs的活细胞恢复率为95±3%，而在生长培养基(MSCGM)组中为6±1%。在相同的保存时间内，hMSCs在其他低温储存介质中的活力恢复分别为:Normosol为64±10%，Plasma-Lyte A为76+4%，AQIX为6±1%，Celsior为16±8%，ViaSpan为32±4%。保存3天后，alamarBlue检测到只有HTS-FRS中储存的hMSCs表现出代谢活性(为常温对照的97±3%)。HTS-FRS中保存5天的hMSCs维持了84+4%（与对照组相比）的代谢活性。

实验结果与讨论

在这个案例研究中我们使用hMSCs代表模型系统，为支持骨髓间充质干细胞的低温储存可用于患者/供体与加工实验室或生产设施之间的短期体外运输，研究了短期2-8℃低温储存的选择。

低温引起的细胞应激积累如肌动蛋白细胞骨架和线粒体分裂和肉芽形成的破坏等可导致低温冷藏1天后活力丧失和恢复。由于ATP生成和离子泵活性减慢，在含胞外存储保护剂的保存液测试组中冷藏避免不了细胞内离子失衡，从而导致正常细胞功能的破坏。含胞内存储保护剂组ViaSpan对活细胞的恢复也不那么有效， HTS-FRS和ViaSpan之间hMSC活力的差异可能是由于HTS-FRS与ViaSpan中的渗透物不同，而线粒体应激的减少可能是由于两种配方中的胞内离子浓度。因此在类似的储存条件下本研究中测试的所有其他生物保存介质都无法支持细胞在任何水平上恢复超过24小时，HTS-FRS提供的低温储存和稳定性优势已经在许多细胞和组织应用中得到了描述^[2-3]，也被纳入了许多临床应用^[1,4,5]。

01-

使用HypoThermosol FRS (HTS-FRS)，这种含胞内存储保护剂、无血清和无蛋白的低温水生物保存介质，可以改善人间充质干细胞(hMSCs)的恢复和维持。HTS-FRS已被证明在72小时内支持近100%的hMSCs回收率，并在冷藏120小时内保持高水平的活细胞回收率(~80%)。

02-

与其他含胞外细胞保存介质溶液相比，HTS-FRS在保存后显示出更好的功能恢复。代谢指标alamarBlue检测显示，与其他培养基相比，储存在HTS-FRS中的hMSCs具有更高的活细胞回收率。

03-

HTS-FRS中储存的hMSCs在低温储存3天后表现出坚固的形态，完整的肌动蛋白细胞骨架和视觉上完整的单层细胞。相反储存在其他含胞外细胞保存介质溶液中的hMSCs表现出细胞数量减少和形态异常，如肌动蛋白细胞骨架受损所示。

BioLife Solutions公司 HypoThermosol 2-8℃生物保存介质

HypoThermosol主要产品特点：

·适用于2-8℃生物组织细胞保存介质；

·cGMP制造，无DMSO、无血清、无蛋白、无动物源性成分；

·减轻细胞和组织冻融过程中发生的温度诱导的分子细胞应激反应，用于客户研究和临床应用；

·为细胞治疗起始源材料和最终细胞制剂的运输提供了长达多天的细胞和组织储存。

参考文献

1. Buskirk RG Van, Baust JM, Snyder KK, Mathew AJ, Baust JG. Successful Short- and Long-Term Preservation of Cells and Tissues.Bioprocess Int. 2004; 42–9. 

2. Mathew AJ. I’m Losing Cell Viabili¬ty and Functionat Different Points in My Process, and I Don’t Know Why! Bioprocess Int. 2010: 54–7. 

3. Bessems M, Doorschodt BM, van Vliet AK, van Gulik TM. Preservation of rat livers by cold storage: a compar¬ison between the University of Wis¬consin solution and Hypothermosol. Ann. Transplant. 2004; 9: 35–7. 

4. Povsic TJ, O’Connor CM, Henry T et al. A double-blind, randomized, controlled, multicenter study to assess the safety and cardiovascular effects of skeletal myoblast implantation by catheter delivery in patients with chronic heart failure after myocardial infarction. Am. Heart J. 2011; 162. 

5. Powell RJ, Comerota AJ, Berceli SA et al. Interim analysis results from the RESTORE-CLI, a randomized, dou¬ble-blind multicenter phase II trial comparing expanded autologous bone marrow-derived tissue repair cells and placebo in patients with critical limb ischemia. J. Vasc. Surg. 2011; 54: 1032–41.