简介

传统的2D细胞模型不能有效体现药物在体内复杂的信号和与细胞的相互作用，因此具有明显的局限性。相比之下，3D细胞模型更能够精确地模拟药物在机体内的药理和毒理反应，缩小与动物模型药物测试数据的差距，在制药行业的药物发现和开发过程中愈发重要。

InSphero在肝脏毒理学、代谢疾病和肿瘤学等领域开发了基于3D细胞的分析解决方案。这些复杂体外系统的工业应用需要组织模型、细胞培养板和液体处理仪器的完美配合。

InSphero的Akura 96和384球体微孔板的独特设计允许使用者在简单、灵活和自动化的平台上开展一系列的实验操作，包括细胞微球的生长、培养、观察和测试。高通量、自动化的实验需求要求液体处理系统能够方便、快速、可靠和精确地交换介质、取样、加药以及在多个平板间进行细胞球体的转移。

本文以VIAFLO 96和VIAFLO 384液体处理系统为例，介绍如何使用液体工作站为Akura 96和384孔微球培养板进行培养基更换，以提高实验通量和工作效率。

一、关键性能参数

·超低吸附的Akura 96和384孔微球培养板可以通过细胞自聚集的方式简便地形成750μm以下直径的无支架细胞微球（每孔一个）。

·以SureXchange为特色的特殊深孔设计以及换液平台可在单次移液步骤中轻松、彻底（移除>90%的介质）地交换介质，并防止球体损失，在长时间周期的培养和分析过程中提高产量。

·直径为1 mm的平底观察窗可实现简单的细胞观察，与标准96和384孔细胞培养板相比，更大的孔间距离有效减少成像时的信号串扰。

·准确的自动化移液系统，对于确保将相同数量的细胞接种到所有孔中并生成高度均匀的细胞微球模型至关重要。它还能够添加正确浓度的药物，并保证不同孔之间的介质交换相等，以确保反应具有高再现性。

·多种用户定义的位置设置可用于精密移液操作，如介质交换。可以设置Z轴高度，以确保在相同高度执行所有后续操作——移液管尖端可精确定位在细胞微球上方，以便可靠转移，减少对于细胞模型的损坏。

·通过调节移液速度可以确保介质的安全交换，减少细胞微球因剪切力或湍流造成的损坏。

二、实验步骤

INTEGRA的自动化液体工作站VIAFLO 96（图1）和VIAFLO 384适用于Akura 96和384孔微球培养板的介质交换。实验步骤经过优化，以确保最小的细胞微球损失。

图1：INTEGRA VIAFLO 96自动化移液工作站

实验程序一  Akura 96孔微球培养板的吸液/收样操作

装载300µl无菌滤芯吸头，在试剂平台上（位置B ）放置一个300 ml兼容自动化液体工作站的试剂槽。将Akura 96孔微球培养板的板盖放置在操作平台上（位置A），开口朝下。将包含细胞微球的Akura 96孔微球培养板放在盖子上——这样的拜访允许手动调整微孔板的位置，使其相对于中轴线产生较小的水平偏移（1-2 mm）（图2a和图3），以确保移液管尖端位于细胞孔的SureXchange处，防止意外吸入细胞微球。

图2：(a) 移除培养基期间，将吸头尖端定位在Akura 96孔微球培养板的SureXchange换液平台上；(b)添加培养基

选择自定义程序“M_ ASP_96_MAN”。移液管以速度1吸入75µl培养基：低速将球体可能受到的剪切力降至最低；吸入体积设置为大于孔内培养基体积（>70µl）以确保完全去除培养基。微孔板底部的特殊设计可保护细胞微球，并留下5-7µl残留体积的培养基。更换微孔板后可以重复该吸液步骤，共可重复3次（即连续4次吸液）。最后一个吸液步骤完成后，将吸头移至试剂平台（位置B）。仪器屏幕上的提示告知用户需要将培养基吹扫至废液桶或收集板。吹扫步骤以速度8执行，随后弹出并丢弃吸头。程序可以设置循环，可将4个吸液步骤和吹扫步骤重复100次，最多可以处理400块微孔板。待所有微孔板的吸液操作处理完成后，程序将终止。

如果拟对培养基进行取样以进行下游分析，则必须在每个吸液步骤后将吸头内的样品分配到相应的收集板中。

实验程序二  Akura 96孔微球培养板的补液操作

丢弃使用过的吸头，将新的300µl无菌滤芯吸头装载到VIAFLO 96上。在试剂平台（位置B）上放置一个装有新鲜培养基的兼容自动化液体工作站的试剂槽（放入10 ml体积的额外培养基，以防止吸入空气）。将Akura 96孔微球培养板放置在操作平台（位置A）的板盖（板该放置同实验程序一）上，手动调整培养板以产生较小的水平偏移（1-2 mm）。

图3：微球培养板相对于吸头中轴线的1-2 mm水平偏移

选择并运行自定义程序“M_DISP_96_MAN”。将吸头移至试剂平台（位置B）的试剂槽，吸入290µl新鲜培养基（足以用70µl体积培养基填四个培养孔，并留有10µl多余体积）。将移液管头移至操作平台（位置A），并将吸头尖端轻轻探入Akura 96孔微球培养板的相应培养孔中，直到降至最低处（图2b）。

缓慢地将70µl培养基分配到培养孔中。更换微孔板后可以重复该补液步骤，共可重复3次（即连续4次补液）。仪器将提示用户清除留在尖端中的培养基。补液步骤以较低的速度执行。程序可以设置循环，可将4个补液步骤重复100次，最多可以处理400块微孔板。

实验程序三  Akura 384孔微球培养板的吸液/收样操作（图4和图5）

详细流程请参照实验程序一，其中：

1.仪器使用VIAFLO 384；

2.吸头使用125µl无菌滤芯吸头；

3.程序使用“M_ASP_384_MAN”；

4.吸液使用速度1吸入70µl培养基（吸入体积设置为大于孔内培养基体积，即>50µl），培养孔内会留下2-3µl残留体积的培养基；

5.程序可以设置循环，每个循环包括1个吸液步骤和吹扫步骤。

图4：Akura 384孔微球培养板的底部设计

实验程序四  Akura 384孔微球培养板的吸液/收样操作（图4和图5）

详细流程请参照实验程序二，其中：

1.仪器使用VIAFLO 384；

2.吸头使用125µl无菌滤芯吸头；

3.程序使用“M_DISP_384_MAN”；

4.吸取110µl新鲜培养基（足以用50µl体积培养基填两个培养孔，并留有10µl多余体积）；

5.以较低的速度缓慢地将50µl培养基分配到培养孔中；

6.更换微孔板后可以重复该补液步骤，共可重复1次（即连续2次补液）；

7.程序可以设置循环，可将2个补液步骤重复100次，最多可以处理200块微孔板。

三、实验提示

·Z轴高度可能因系统而异，可以预先使用模拟板测试合适的高度。

·吸头尖端需要位于细胞微球上方0.2-0.3 mm处——过低的吸头尖端位置可能会对细胞微球造成损伤。

·Akura 384孔微球培养板的底部设计是非轴对称的，因此在进行操作的时候，需要将培养板正对操作者（A1孔位于左上角，P1孔位于左下角）。

图5：(a) 移除培养基期间，将吸头尖端定位在Akura 384孔微球培养板的SureXchange换液平台上；(b)添加培养基

四、结果展示

三个独立的实验表明，在九次连续的培养基更换后（更换多于90%的培养基），Akura 384孔微球培养板的球体损失率小于1%（图6）。

图6：连续培养基更换后的细胞微球留存率

五、相关产品

1、Akura 96孔微球培养板：

https://www.mine-bio.com/InSphero/Akura96SpheroidMicroplate.shtml

2、Akura 384孔微球培养板：

https://www.mine-bio.com/InSphero/Akura384SpheroidMicroplate.shtml