Akura 96 Spheroid Microplate

产品简介

InSphero Akura 96/384孔超低吸附细胞微孔板是一种简单、灵活且能兼容高通量和自动化系统的操作平台，用于无支架的3D细胞培养、观察和观测。每块InSphero Akura 96/384孔超低吸附细胞微孔板都是由超低吸附的培养孔和用于减少培养基蒸发的板盖组成。适用于永生或改良细胞系、原代细胞以及诱导性多能干细胞（iPS cells）等已知可以用于3D细胞培养的细胞类型形成类器官、细胞微球体或细胞微组织。此外，InSphero Akura 384孔细胞微孔板的底部是一层透气膜，可以保证长时间培养时充足的气体交换。

产品特色

InSphero Akura 96/384孔超低吸附细胞微孔板的独特设计可以帮助客户更好地开展高通量的体外3D细胞培养实验。从远处看，InSphero Akura 96/384孔细胞微孔板和普通的细胞微孔板的外观没有明显不同，尺寸符合SLAS/ANSI标准，可以完美兼容常规的实验操作以及仪器。

从近处观察，便可以发现其创新型设计的微妙之处：微孔板中的每个孔都拥有类似“倒置烟囱”的形状以及一个被称为“SureXchange ledge”的吸头停靠处以便于更换培养基。InSphero Akura 96孔细胞微孔板的吸头停靠处呈轴对称，而InSphero Akura 384孔细胞微孔板只有单侧的吸头停靠处。在更换培养基时，只需要将吸头的尖部停靠在这里，便能得到一个合适的触觉反馈，避免将吸头伸入过深的位置而对培养的细胞微球产生影响。微孔板的培养孔壁有一层耐用的涂层，可以有效防止细胞微球体在培养的过程中发生附着。

InSphero Akura 384孔细胞微孔板由24列、16行培养孔构成，列由数字1-24表示，行由字母A-P标识，孔A1标识整板左上角的孔，而P1标识整板左下角的孔，由A1和P1孔可以确定整块微孔板的方向（图2）。InSphero Akura 384孔细胞微孔板的培养孔结构是非对称的，吸头停靠处位于培养孔靠近微孔板上侧的位置，而供细胞微球体生长的空穴位于培养孔靠近微孔板下侧的位置。在使用InSphero Akura 384孔细胞微孔板时应特别注意微孔板的方向，避免不正当的操作对实验结果产生影响。

产品优势

1. 利用超低吸附的微孔板中便捷地获得细胞自聚集形成的细胞微球

2. 独特的培养孔设计使得更换培养基的过程更加轻松，可以有效避免细胞长期培养时因为更换培养基导致的细胞微球的丢失或损伤

3. 培养孔的底部设有直径为1mm的平底观察窗，可以方便地进行细胞微球的定位和观察，避免了一般圆底ULA板成像时的局部变形

4. InSphero Akura 384孔细胞微孔板可以与更先进的成像和自动化液体处理系统兼容以开展高通量实验，培养孔独特的黑色壁体可以有效消除孔间的荧光串扰

自备材料

1. 实验细胞与合适的培养基

2. 倒置显微镜

3. 细胞计数工具

4. 移液器/自动化液体处理系统

5. 板孔离心机

6. 二氧化碳培养箱（设置为5%浓度二氧化碳，95%相对湿度，37摄氏度）

实验前准备

1. 培养基于37摄氏度预热

2. 用70%乙醇擦拭微孔板的外包装

3. 在无菌操作环境下小心地打开微孔板的外包装

实验步骤

预湿润

* 推荐在无菌操作环境下执行预润湿的操作，可以有效防止培养孔中的气泡产生。

1. 向孔内加入40uL含有FCS或BSA的培养基，加入时注意使移液器的吸头尽量靠近培养孔的底部，但是注意不要触碰到培养孔的底部（对于InSphero Akura 96孔细胞微孔板，推荐使用8/12通道移液器以缩短操作时间）。

2. 使用移液器吹洗培养基以湿润培养孔，此步骤应小心操作避免产生气泡。

3. 将吸头停靠在培养孔内的吸头停靠处（此处非常重要，请仔细参考前文的“产品特色”部分，不正确的操作可能会损坏微孔板并影响其性能），将孔内的所有培养基吸出（根据微孔板的设计，InSphero Akura 96孔细胞微孔板将残留少于5-7uL的培养基，InSphero Akura 384孔细胞微孔板将残留少于2-3uL的培养基，可以忽略不记）。

细胞接种

1. 依据实验设计，将要接种的细胞或细胞混合物制备成单细胞悬液。

2. 使用血球计数板或其他合适的细胞计数工具进行细胞计数，并确定合适的细胞接种密度。

3. 使用移液器充分吹洗细胞悬液，确保悬液中的细胞均匀分布，并取合适数量的细胞，用培养基将体积补足70uL（InSphero Akura 96孔细胞微孔板）/50uL（InSphero Akura 384孔细胞微孔板）。

* 推荐的细胞接种密度：用于增殖细胞的长期培养，建议使用较低的起始密度，建议每孔接种250-500细胞；用于非增殖细胞的培养或需要快速获得较大体积的细胞微球体，建议每孔接种2500-25000细胞。

4. 缓慢地将细胞液接入微孔板上对应的培养孔中，该过程应尽量保持轻柔（移液速度小于10uL/sec），并尽量避免吸头触碰培养孔的底部。

细胞沉降和细胞微球体形成

* 为了达到更佳的实验效果，可能需要优化细胞培养的条件，例如：调整细胞接种密度或培养基成分，或通过添加支持细胞（supporting cells，如基质分泌细胞）或添加剂（如ECM），对于初次开展3D培养的细胞类型，建议尝试多种的细胞培养条件。

1. 将InSphero Akura 96/384孔细胞微孔板盖好盖子并放入板孔离心机中，250 x g（RCF）离心2min。

* 该离心步骤是选做步骤，不过短暂的离心可以帮助去除培养孔内的残留气泡并帮助细胞沉降至培养孔的底部以促进细胞微球体的生成。

2. 将InSphero Akura 96/384孔细胞微孔板移入二氧化碳培养箱中，并将InSphero Akura 96/384孔细胞微孔板倾斜30°放置或使用InSphero Akura倾斜支架（CS-10-002-00），以促进细胞微球体的形成。

3. 在适宜的条件下培养2-5天，每天观察细胞微球体的形态，并在需要时更换培养基。

培养基更换

* 通常情况下，细胞微球体的培养每周需要更换2-3次培养基，具体更换频率依据实际情况而定

1. 将InSphero Akura 96/384孔细胞微孔板从二氧化碳培养箱中取出，并以合适的方向摆放（尤其是对于InSphero Akura 384孔细胞微孔板）。

2. 将移液器的吸头沿着孔壁慢慢下滑直至感受到吸头停靠处带来的触觉反馈，并将培养孔内的培养基完全吸出（除了培养孔深处残留的微量培养基），此步骤应尽量轻缓，建议的移液速度小于10-20uL/sec。

3. 将移液器的吸头沿着孔壁慢慢下滑直至感受到吸头停靠处带来的触觉反馈，并加入70uL（InSphero Akura 96孔细胞微孔板）/50uL（InSphero Akura 384孔细胞微孔板）预热的新培养基，此步骤应尽量轻缓，建议的移液速度小于10-20uL/sec（对于InSphero Akura 96孔细胞微孔板，移液速度可以适当放宽至小于50uL/sec）。

4. 如果要求更加彻底的培养基更换，可以重复第3-4步。

5. 将InSphero Akura 96/384孔细胞微孔板放回二氧化碳培养箱中继续培养。

* 如需要了解更多操作细节或使用自动化液体处理系统，请联系曼博生物技术支持。

细胞微球体收取或转移-InSphero Akura 96孔细胞微孔板

1. 在收取细胞微球体之前，使用至少60uL的100% FCS预湿润吸头，该步骤可以有效防止细胞微球体黏附在吸头内侧。

2. 方案一：使用1000uL的移液器和吸头，沿着培养孔侧壁缓缓往下移动直到感受到触觉反馈，此时吸头的尖部正好位于细胞微球体的上侧，可以直接吸取细胞微球体。

* 1000uL的吸头尖部直径略微大于培养孔的底部直径，所以可以避免在吸取细胞微球体时对其造成挤压。

3. 方案二：使用100-200uL的移液器和吸头，小心保持一个较小的角度并沿着培养孔侧壁缓缓往下移直至触碰到培养孔底部，吸取细胞微球体。

* 100-200uL的吸头尖部小于培养孔的底部直径，如果不能保持一个较小的倾斜角度可能会导致吸取过程中细胞微球体的挤压受损。

4. 将细胞微球体转移至合适的容器中。

细胞微球体收取或转移-InSphero Akura 384孔细胞微孔板

1. 在收取细胞微球体之前，使用至少50uL的100% FCS预湿润吸头，该步骤可以有效防止细胞微球体黏附在吸头内侧。

2. 单个细胞微球体的收取：使用1000uL的移液器和加长的吸头（如1250uL吸头），沿着培养孔侧壁（靠近板孔下侧的一侧，即吸头停靠处的对侧）缓缓往下移动直到感受到触觉反馈，此时吸头的尖部正好位于细胞微球体的上侧，可以直接吸取细胞微球体。

3. 连续细胞微球体的吸取：InSphero Akura 384孔细胞微孔板可以支持连续的吸取。如需要进行连续细胞微球体的吸取，在实验开始前需要使用130uL的100% FCS预湿润吸头。详细的操作细节，请联系曼博生物技术支持。