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一、引言

原代人肝细胞（PHHs）在临床前药理学和毒理学研究中的应用受到一定限制，部分原因是缺乏便捷的合适培养体系。该体系需要具备以下特点：操作简便，能够支持来自健康和病变组织的多种供体细胞，并能长期维持细胞的结构和功能特性。三明治培养（SC）体系和共培养体系虽已解决部分此类问题，但仍存在局限性。

为突破这些局限，本研究开发了一种全人源三培养体系（TCS），采用原代人肝细胞（PHHs）和原代饲养细胞（FCs）。实验流程如下：将由两种基质细胞按1:1比例组成的冻存人源饲养细胞解冻后，接种到24孔胶原包被板中；然后，将冷冻保存的成人PHH解冻后接种于饲养细胞上，从而构建三重培养系统(TCS)。

在为期3周的培养中，研究评估了细胞的形态与功能，包括白蛋白（Alb）分泌、尿素分泌及细胞色素P450（CYP）活性。结果显示：

1. 来自多个成人供体的原代人肝细胞在TCS中可维持健康稳定的形态（包括多细胞簇形成）长达42天；

2. 培养初始5天内，细胞形成交织的胆小管网络，且该网络具有紧密连接和缝隙连接，在后续培养中持续稳定；

3. 与三明治单培养体系（SC）中的PHHs相比，TCS中PHHs的白蛋白（30-40μg/天/10⁶细胞）和尿素（55-70μg/天/10⁶细胞）生成水平明显更高；

4. 培养第4天，TCS中PHHs的Alb、CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4基因表达水平，平均比SC体系中的PHHs高2倍；

5. 第5天后，Ⅰ相和Ⅱ相代谢功能（咪达唑仑1-羟化速率：10-20pmol/分钟/10⁶细胞；7-乙氧基香豆素葡萄糖醛酸化速率：300-600pmol/分钟/10⁶细胞）稳定维持至少2周。

综上，三培养模型是一种便捷的全人源肝细胞培养体系，可在数周内同时维持肝细胞的形态与代谢功能。

二、材料与方法

1、背景与体系优势

当前，寻找能模拟体内肝脏微环境的培养模型仍面临局限，核心问题是肝细胞难以长期维持形态与功能特性⁽¹⁾。尽管动物模型可用于相关研究，但肝脏代谢和受体信号通路存在物种差异⁽²⁾；单培养和三明治培养体系也存在严重不足，如细胞极性和代谢功能在短期至中期内丧失⁽³⁾。

现有共培养和三培养模型虽将肝细胞与一种或多种饲养细胞结合，但多采用非人源饲养细胞（主要为小鼠或大鼠来源）⁽⁴⁾。本研究新开发的TCS体系则采用两种不同类型的冻存原代人源饲养细胞和PHHs，且冻存细胞试剂盒组件使用便捷，便于研究人员在标准平板格式中控制实验流程，数小时内即可完成体系搭建，适用于需维持肝细胞极性和表型的多种实验场景。

2、实验流程

图1：三培养体系搭建步骤

1. 培养基制备：①过夜解冻；②添加补充剂；③升温至37℃（耗时30分钟）；

2. 饲养细胞接种：解冻、计数并接种FCs（耗时60分钟）；

3. 原代人肝细胞接种：解冻、计数并接种PHHs（耗时2-4小时）；

4. 培养基更换：每日更换培养基。

三、检测方法

1. 蛋白表达检测：通过免疫细胞化学法检测ZO-1、Connexin-32、CK18、白蛋白（Alb）、CYP1A2和VIM（波形蛋白）的表达；使用DAPI进行细胞核复染；使用5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(5µM)(CDFDA)对胆小管进行染色。（图3A：第14天TCS中胆小管的CDFDA染色结果，及ZO-1、Connexin-32、CK18的阳性染色）。

2. 基因表达检测：用RLT缓冲液裂解细胞，通过RNeasyMini试剂盒提取总RNA，使用QuantiNovaSYBRGreenRT-PCR试剂盒制备cDNA；在StepOnePlusRT-PCR系统上进行PCR扩增，并使用StepOne软件进行分析。以GAPDH为内参基因，采用2-∆∆CT法计算相对表达量。

3. 白蛋白与尿素检测：收集细胞上清液，通过ELISA试剂盒检测白蛋白含量，采用比色法测定尿素合成量（图4C、D：TCS中PHHs在22天培养期内的Alb和尿素水平；图5A、B：第7天和第14天SC单培养与TCS中Alb、尿素的对比）。

4. CYP酶活性检测：分别用奥美拉唑（100μM）、CITCO（100nM）和利福平（25μM）诱导PHHs48小时后，采用P450-Glo检测试剂盒（Promega）测定CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的活性（图2B：第4天和第7天不同PHHs:FCs比例下CYP1A2的诱导活性；图4B：42天培养期内TCS与SC中PHHs的CYP3A4诱导活性对比；图6：TCS中CYP1A2、2B6、3A4的诱导情况及相关基因表达）。

5. Ⅰ相代谢检测：以咪达唑仑（15μM）为探针，通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定1'-羟基咪达唑仑（OH-MDZ）的浓度，评估Ⅰ相代谢功能（图5C：第5、7、10、14天OH-MDZ的生成量；下表2：饲养细胞对OH-MDZ生成的贡献，各时间点均值均为0）。

6. Ⅱ相代谢检测：将细胞暴露于100μM7-乙氧基香豆素（7-EC，Sigma），孵育30（60）分钟后收集样本；通过LC-MS/MS分析7-羟基香豆素（7-HC，Ⅰ相代谢产物）、7-羟基香豆素葡萄糖醛酸苷（7-HCG）和7-羟基香豆素硫酸盐（7-HCS，均为Ⅱ相代谢产物）的生成量（图5D：14天培养期内3种代谢产物的变化）。

表1.原代人肝细胞供体信息表

四、结果与结论

1. 形态稳定性：TCS中的PHHs在无胶原或基质胶包被的情况下，体外可维持肝细胞形态长达42天，且形成具有紧密连接和缝隙连接的交织胆小管网络（图3：TCS中胆小管形成及蛋白标志物表达；图4A：42天培养期内SC单培养与TCS（无基质胶）的形态对比）。

2. 功能稳定性：测定Alb和尿素水平显示，TCS中的PHHs在超过22天的培养期内保持功能稳定；与SC单培养相比，TCS中PHHs的Alb、尿素生成量及CYP活性明显更高（图4C、D；图5A、B）。

3. 代谢稳定性：第5天后，TCS中PHHs的Ⅰ相（如OH-MDZ生成）和Ⅱ相（如7-HCG、7-HCS生成）代谢功能稳定维持至少2周；基于CYP和尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）的酶活性及核受体在此期间也保持稳定（图5C、D）。

4. 供体适用性：来自多个成人供体的PHHs在TCS中均能维持健康形态与功能，且不同供体（如E、F、G）的CYP3A4诱导活性在16天培养期内持续稳定（图6B）。

因此，三培养体系（TCS）是一种便捷、稳定且可重复的体系，适用于药物研发和风险评估中的药理学与毒理学研究。

结论

• TCS中的原代人肝细胞（PHHs）在无胶原或基质胶（Matrigel）包被的情况下，体外可维持肝细胞形态长达42天。

• 该体系中的原代人肝细胞形成了具有紧密连接和缝隙连接的交织胆小管网络。（图3：TCS中胆小管形成及蛋白标志物表达；）

• 当以白蛋白（Alb）和尿素水平为检测指标时，三培养体系中的原代人肝细胞在超过22天的时间内保持功能稳定。

• 与三明治单培养体系（SC）中的原代人肝细胞相比，三培养体系中的原代人肝细胞具有明显更高的白蛋白（Alb）生成量、尿素生成量及细胞色素P450（CYP）活性。

• 在此期间，基于细胞色素P450（CYP）和尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）的酶活性以及核受体也保持稳定。

表2：饲养细胞对OH-MDZ生成的贡献

图2.三培养体系（TCS）中适宜原代人肝细胞（PHHs）与饲养细胞（FCs）比例

（A）第4天和第7天，不同接种密度（1.5:1、3:1、6:1）的原代人肝细胞（PHHs）与饲养细胞（FCs）的代表性图像；

（B）第4天（灰色柱）和第7天（黑色柱）细胞色素P4501A2（CYP1A2）的诱导水平与未诱导组原代人肝细胞（PHHs）的对比。误差线代表标准差（n≥3个复孔）。放大倍数10倍。

图3.三培养体系（TCS）中胆小管的形成及蛋白标志物的表达

（A）第14天对胆小管进行CDFDA染色的结果；ZO-1（紧密连接蛋白1）、连接蛋白-32（Connexin-32）及细胞角蛋白18（CK18）均呈阳性染色；

（B）三培养体系（TCS）中原代人肝细胞（PHHs）的白蛋白（Alb）和细胞色素P4501A2（CYP1A2）呈阳性表达；饲养细胞（FCs）经波形蛋白（Vimentin，缩写Vim）染色呈阳性。放大倍数10倍。

图4.三培养体系（TCS）的长期稳定性

（A）42天培养期内，三明治单培养体系（SC）与无基质胶（Matrigel）包被的三培养体系（TCS，-MG）的代表性图像（D42表示第42天）；

（B）42天培养期内，三培养体系（TCS，黑色柱）中原代人肝细胞（PHHs）的CYP3A4诱导活性与三明治单培养体系（SC，灰色柱）的对比；

（C）22天培养期内，三培养体系（TCS）中原代人肝细胞（PHHs）的白蛋白（Alb）水平；

（D）22天培养期内，三培养体系（TCS）中原代人肝细胞（PHHs）的尿素水平。

误差线代表标准差（n≥3个复孔）。放大倍数10倍。

图5.三培养体系（TCS）中原代人肝细胞（PHHs）的功能验证

（A）第7天（灰色柱）和第14天（黑色柱），三明治单培养体系（SC）与三培养体系（TCS）中原代人肝细胞的白蛋白（Alb）水平；

（B）第7天（灰色柱）和第14天（黑色柱），三明治单培养体系（SC）与三培养体系（TCS）中原代人肝细胞的尿素水平；

（C）以1-羟基咪达唑仑（1-hydroxymidazolam，缩写OH-MDZ）为检测指标，于第5天、第7天、第10天和第14天测定Ⅰ相代谢功能；

（D）14天培养期内，对Ⅰ相代谢产物7-羟基香豆素（7-hydroxycoumarin，缩写7-HC，灰色圆圈）及Ⅱ相代谢产物7-羟基香豆素葡萄糖醛酸苷（7-hydroxycoumaringlucuronide，缩写7-HCG，黑色圆圈）、7-羟基香豆素硫酸盐（7-hydroxycoumarinsulfate，缩写7-HCS，黑色三角形）的生成情况进行检测。***p≤0.001，与第14天三明治单培养体系（SC）相比具有更明显的统计学差异。

图6.三培养体系（TCS）中CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4的诱导情况

（A）第4天，三培养体系（TCS）与三明治单培养体系（SC）中CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4诱导水平的对比表；

（B）将3个不同供体的原代人肝细胞样本（E、F、G样本）在三培养体系（TCS）中培养16天，分别于第4天（灰色柱、黑色柱）、第10天（条纹柱）和第16天（白色柱、格子柱）测定未诱导组（灰色柱、水平条纹柱、白色柱）和CYP3A4诱导组（黑色柱、垂直条纹柱、格子柱）的酶活性；

（C）第4天，三培养体系（TCS，黑色柱）中原代人肝细胞（PHHs）的白蛋白（Alb）、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4及载脂蛋白1（Apolipoprotein1，缩写APOA1）的基因表达水平，与三明治单培养体系（SC，灰色柱）中原代人肝细胞的基因表达水平对比。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，与三明治单培养体系（SC）相比具有统计学差异。误差线代表标准差（n≥3个复孔）。

参考文献

1. LeCluyse,E.L.,Witek,R.P.,Andersen,M.E.,Powers,M.J.,2012.Organotypicliverculturemodels:Meetingcurrentchallengesintoxicitytesting.CriticalReviewsinToxicology,42(6),501-548.

2. Olson,H.,Betton,G.,Robinson,D.,Thomas,K.,Monro,A.,Kolaja,G.,etal.,2000.Concordanceofthetoxicityofpharmaceuticalsinhumansandinanimals.RegulatoryToxicologyandPharmacology,32(1),56-57.

3. Khetani,S.R.,Bhatia,S.N.,2008.Microscalecultureofhumanlivercellsfordrugdevelopment.NatureBiotechnology,26(1),120-126.

4. Ware,B.R.,Durham,M.J.,Monckton,C.P.,Khetani,S.R.,2017.ACellCulturePlatformtoMaintainLong-TermPhenotypeofPrimaryHumanHepatocytesandEndothelialCells.CellularandMolecularGastroenterologyandHepatology,5(3),187-207.