一、MSC、EVs和衰老背后的生物学

《传道书》中的智者曾感叹：“日光之下并无新事。”然而，有一件事在千百年来始终未曾改变，那就是人类渴望延缓衰老和死亡的步伐。或许我们无法阻止衰老的发生，但至少可以减少因衰老而带来的疾病和痛苦。现代医学和科技的进步为这一目标提供了希望，尤其是间充质干细胞（MSCs）在衰老研究中的潜力，成为了当下的研究热点。

间充质干细胞（MSCs）是多能干细胞，能够分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞，甚至可能分化为其他几种细胞类型。

图1. The Mesengenic Process。间充质发生过程，阐释间充质干细胞（MSC）可以被诱导进入几种不同间充质谱系路径中。图片来源于文章DOI 10.1016/j.stem.2011.06.008

MSCs 具有较强的自我更新能力，并能进行多轮细胞分裂，这些干细胞储存在人体内，直到因受伤或疾病的需要被召回并“激活”。一旦被激活，MSCs 会参与修复过程，填补受损的血管，向疲惫的修复细胞捐赠线粒体，并分化为骨、软骨、脂肪或成纤维细胞。这些细胞的分泌物（secretomes）包括细胞因子、生长因子和细胞外囊泡（EVs，尤其是外泌体），这些成分具有抗炎作用和促血管生成作用，能够引导一系列有序的创伤修复和再生细胞活动。

图2. 间充质干细胞具有免疫调节和营养支持作用。图片来源于文章DOI 10.1016/j.stem.2011.06.008

随着年龄的增长，人体内的细胞逐渐受损，尤其是基因组和线粒体等结构的退化。细胞会随着时间的推移逐渐积累损伤，导致功能的下降，直到触发细胞的凋亡。衰老细胞常被称为“僵尸细胞”，它们会分泌与衰老相关的因子，促进局部的炎症反应和纤维化，影响周围健康细胞的功能。近年来的研究发现，去除这些衰老细胞或清除它们的分泌因子，甚至通过引入新的年轻或健康的细胞来替代受损细胞，可能成为减缓衰老相关慢性疾病发展的有效策略。

间充质干细胞（MSCs）正是这种潜力的体现。MSCs 对组织培养的适应性和自身的强韧性，使其成为理想的支持细胞，能够在多细胞类型的组织工程支架中发挥重要作用，例如用于心肌、肝脏、角膜、气管、主动脉及皮肤等多种组织的修复和再生。通过 MSCs 和它们的分泌物，或许能在不改变生物学极限的情况下，减缓衰老进程，延缓衰老相关疾病的发生。

图3. 细胞外囊泡(EVs)的异质性。细胞外囊泡（EVs）是异质的、由磷脂膜包裹的结构。根据其生物发生机制，主要将EVs分为两种类型，分别为外泌体（exosomes）和外源性囊泡（ectosomes）。详情可参考原文：https://doi.org/10.1038/ s41577-022-00763-8

二、大规模EVs制造探索

近年来，hMSC-EVs 的需求急剧增加，突显了对可放大生物反应器的大规模生物制造的需求。然而，EVs 的生物发生过程对体外培养微环境敏感。接下来小编将分享一篇近期的研究，主题是关于 “不同培养方式下的外泌体生产效率研究、以及EVs质量和功能如何”的研究。这里可以将MSCs分泌的EVs理解为“小包裹”，里面装着脂质、蛋白质、核酸等这些对身体有用的 “治疗物质”。 但之前的问题是：这种 “小包裹” 产量太低，没法满足临床治疗的需求，所以需要找到能 “大规模生产” 它们的方法。

1、不同培养方式下的EVs生产效率研究

研究团队找了4种不同的 “培养方式”，来养脂肪来源间充质干细胞，看看哪种能产出更多、更好的EVs：

1. 2D 平面培养：就像在孔板里养细胞，是以前常用的方式；

2. ULA 3D静态聚集体培养：在特殊盘子里让细胞聚成团养，但不怎么动；

3. SFB 动态3D培养（微载体依赖）：一种能旋转的设备，让细胞在里面动态培养；

4. VWBR 动态3D培养（聚集体，无微载体）：搅拌机制优化的动态设备，提供相对温和均匀可控的流体动力学环境，让细胞在更舒适的体外环境中培养。

图4. 实验流程示意图。(A) 实验流程图，包含生物反应器设置、取样日期和实验概览。实验中用的Synthemax II 微载体。具体接种细胞数、接种效率、接种密度可参考原文。 (B) 实验生物反应器、静态聚集体对照组和二维对照组示意图。图中展示了hMSC的接种过程及收集的EVs。

之后研究团队做了三件关键的事：

1. 收集各种培养方式下干细胞分泌的 “小包裹”- EVs，测一测产量（多少个）、大小，还有和 “小包裹生成” 相关的基因有没有更活跃；

2. 测试这些 “小包裹” 的功能：比如能不能减少细胞的 “氧化应激”（相当于身体里的 “自由基伤害”）、能不能抑制炎症（比如减少导致炎症的 “坏因子” TNF-α）；

3. 模拟疾病场景测试：在类似阿尔茨海默病的模型里，看看 “小包裹” 能不能减少神经退化；还尝试把 “小包裹” 包在水凝胶里送进细胞，看看这种 “递送方式” 能不能提高抗炎效果。

2、关键结果：发现了啥有用的结论？

（1）动态生物反应器（尤其是 VWBR）比传统 2D 培养 “多产” 多了：

• VWBR 产出的EVs 总量，比 2D 培养多了 1 倍多；比旋转瓶反应器也多出30%左右；

• 不管是每毫升培养基、还是平均每个干细胞产出的EVs都比 2D 培养多，而且相关的 “生成基因” 也更活跃（见原文）。

图5. 不同培养系统中细胞外囊泡的分泌情况，由纳米颗粒追踪分析（NTA）表征

(A) 从NTA计算得出的总EV产量。

(B) 按照培养基生产力归一化的EV产量（单位为每毫升培养基中的EV颗粒数）。结果显示，在SFB组中单位培养基生产力明显提高，几乎增加了2倍，而在VWBR组中则增加了3倍。

(C) 按照细胞生产力归一化的EV产量（单位为接种时D0的细胞计数下的EV颗粒数）。N = 3；* p < 0.05，** p < 0.01。EV的尺寸以均值 + 标准差表示。

EV尺寸分布图：(D) 平均尺寸；(E) 众数尺寸；(F) 中位尺寸。(G) 2D样本；(H) SFB；(I) VWBR。

（2）“小包裹” EVs的体外功能分析：  

• 能明显减少 “氧化应激” 和炎症，比如在模拟阿尔茨海默病的模型里，能降低炎症因子，还能减少神经退化的标志；

图6. 在Aβ42寡聚体或阿尔茨海默病（AD）类器官培养基处理下，hMSC EVs的体外功能性实验。

(A) 电子传输显微镜（TEM）图像显示EVs。尺度条：60 nm。

(B) 四种不同EV样本的外泌体标志物Western blot分析。

(C) TNF-α分泌的ELISA分析。(I) Aβ42寡聚体增加了hMSC的TNF-α分泌；(II) EV处理Aβ42寡聚体刺激的细胞；

(D) 暴露于APOE4阿尔茨海默病（AD）相关脑类器官培养基的iPSC来源的围绕细胞（iPCs）。评估了hMSC EV处理对反应性氧种（ROS）生成的影响。(I) ROS定量；(II) ROS图像。尺度条：50 μm。*p < 0.05；*** p < 0.001。

图7. 在阿尔茨海默病（AD）类脑器官培养基处理下，hMSC EVs对iPCs神经炎症和神经退行性标志物表达的影响。基因表达通过RT-qPCR进行测定。

(A) 炎症标志物；(B) 抗炎标志物；(C) 神经退行性标志物。N = 3。p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001，与对照组（无AD培养基和无EVs）比较。

• 把“小包裹”包在水凝胶里递送，抗炎效果更好（能阻止炎症相关的 NF-κB 信号激活）。（数据可见原文章）

三、总结

hMSCs 及其分泌的 EVs 因具有免疫调节和组织修复潜能，在退行性、炎症性疾病治疗中备受关注，但传统 2D 培养的 EVs 产量低，难以满足临床需求。文中分享的研究探究了在不同培养体系（尤其是可扩展生物反应器）对脂肪来源 hMSCs 分泌 EVs 的影响，同时验证 EV 的生物学功能，为 hMSC-EVs 的大规模生产和临床应用提供依据。提示生物反应器微环境（如流体动力学、剪切应力）可能通过调控 EVs 生物合成基因表达影响 EVs 产量，为进一步优化培养体系提供了理论基础。

参考资料

1. 原文章DOI: 10.3390/bioengineering12090933（链接：https://doi.org/10.3390/bioengineering12090933）

2. https://www.roosterbio.com/blog/mscs-exosomes-and-aging/