iPSC诱导性多能干细胞分化为星形胶质细胞

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一、前言

星形胶质细胞是人类中枢神经系统中 most丰富的胶质细胞，对维持健康的脑功能很重要。它们调节神经递质的摄取、离子和代谢稳态、突触活动以及血脑屏障的完整性，同时还参与神经免疫信号传导、炎症反应、损伤反应和神经元存活。它们保护神经元免受兴奋性毒性损伤、调节突触网络以及维持细胞外环境的能力，使其成为中枢神经系统整体生理功能的基础[1]。

越来越多的证据表明，星形胶质细胞功能障碍与多种神经系统疾病和神经退行性疾病的发病机制有关，包括阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、帕金森病和癫痫。因此，生理相关的人类星形胶质细胞模型对于增进我们对中枢神经系统生物学、疾病机制的理解，以及药物发现和神经毒性测试很重要[2]。

鉴于星形胶质细胞广fan的调控作用，它们已成为神经发育障碍、神经退行性疾病、精神疾病以及脑癌研究的核心。星形胶质细胞信号传导、成熟或代谢支持功能障碍已被认为是多种疾病的致病因素，从常见的神经退行性疾病到胶质瘤，这凸显了构建生理相关的人类星形胶质细胞模型的必要性[3,4]。

人类诱导多能干细胞 (iPSCs) 为构建此类模型提供了理想的方法。iPSC -星形胶质细胞具有基因定义、可再生性和患者特异性，从而能够对疾病机制、细胞间相互作用、发育过程和治疗反应进行可控研究。它们的分化通常能够重现体内发育阶段，包括神经诱导、放射状胶质细胞分化和胶质细胞生成，最终产生表达关键标记物（如 GFAP、EAAT1/2 和 ALDH1L1）的星形胶质细胞 [5]。

本应用说明介绍了一种从诱导多能干细胞 (iPSCs) 生成功能性人星形胶质细胞的精简且可重复的工作流程。该方法采用明确的培养条件和优化的培养基配方，以提gao效率、缩短分化时间并增强结果的一致性。所得星形胶质细胞具有特征性的形态、标记物表达和功能特性，使其适用于疾病建模、神经炎症研究和高通量化合物筛选等下游应用。

二、方法

1、细胞培养和维护

每周两次使用0.5 mM EDTA进行iPSC的传代培养，使其脱离细胞。然后，以1:6的分流比例接种于涂有vitronectin（Qk120，浓度5 µg/ml）的6孔板中，并在E8类培养基中培养。传代后的第二天，弃去用过的培养基，换上5 ml新鲜的E8类培养基，从而实现周末无需换液的培养计划。有关此过程的更多信息，请点击参阅我们的指南，了解如何使用Qkine公司的耐热FGF-2 (bFGF)，结合我们不含动物源性的TGF-β1 ( Qk010 )和 vitronectin，进行周末无需换液的人类诱导多能干细胞培养，以提高菌落的均质性。

图1.星形胶质细胞分化时间表

2、胚状体（EB）形成（第0天）

人类诱导多能干细胞 (iPSC) 在标准条件下培养，并在汇合度达到约 70-80% 时用于分化（图 1）。

将iPSCs以5 × 10⁵个细胞/ml的密度接种于添加了10 µM Y-27632（ROCK抑制剂）的神经胚状体（EB）形成培养基中（表1），以提高细胞存活率。将细胞转移至低吸附培养板，并以800 x g离心3分钟，以促进细胞聚集和胚状体（EB）的形成。

表1.神经EB形成培养基成分+ROCK抑制剂

3、神经诱导（第1-5天）

胚状体在与神经胚状体形成培养基配方相同的培养基中培养（表1），但不添加ROCK抑制剂。每天小心更换培养基，以避免破坏胚状体聚集体。此阶段促进了早期神经诱导和模式形成。

4、放射状胶质细胞分化（第6天）

使用 Accutase 将胚状体 (EB) 解离成单细胞，并以 5 × 10⁵ 个细胞/ml 的密度接种于预先包被 0.5 µg/ml Matrigel 的 6 孔板中。细胞在基于 Neurobasal 的培养基 1（表2）中培养，以促进放射状胶质前体细胞的形成。

表2.基于Neurobasal的培养基成分1

5、早期星形胶质细胞分化（第7-11天） 

从第7天到第8天，细胞每天都使用相同的 Neurobasal 培养基 1 进行更换（表 2）。

从第9天到第11天，在 Neurobasal 培养基 1 中也添加了 CNTF（ Qk063，20 ng/ml），以启动星形胶质细胞谱系分化（表3）。

表3.基于Neurobasal的培养基成分2

6、星形胶质细胞分化（第12-29天）

从第12天到第14天，细胞在 Neurobasal 培养基 3 中培养，每天更换培养基（表4）。

表4.基于Neurobasal的培养基成分3

7、成熟

从第15天开始（第 15、16、17、19、21、23、25、27和29天），继续使用相同的配方更换培养基，但不添加FGF2-G3以促进星形胶质细胞成熟（表5）。

表5.基于Neurobasal的培养基成分4

8、免疫细胞化学和成像（第32-34天）

在第32天，细胞经固定和透化处理后，与针对星形胶质细胞标志物（即GFAP、EAAT1、EAAT2和ALDH1L1）的一抗孵育。第33天，进行二抗染色。从第34天开始，使用荧光显微镜对细胞进行成像，以评估星形胶质细胞的形态和标志物表达。

三、结果

免疫细胞化学 (ICC) 分析表明，iPSC衍生的细胞获得了星形胶质细胞表型。分化后，培养物中的细胞具有大的星形胞体和多个细长的突起，与体外星形胶质细胞的特征形态一致。标记染色证实了星形胶质细胞特异性蛋白的表达（图2）：GFAP标记遍布胞质和突起，而 EAAT1 和 EAAT2 定位于质膜。ALDH1L1 的表达也遍布胞质，进一步证实了星形胶质细胞的特性。

图2. 分化型iPSC中星形胶质细胞标记物的免疫细胞化学染色。相差显微镜图像（A）；GFAP和Hoechst 33258（绿色表达和蓝色表达，B）；GFAP（绿色，C）；相差显微镜图像（D）；ALD1L1和Hoechst 33258（绿色表达和蓝色表达，E）；ALD1L1（绿色，F）；相差显微镜图像（G）；EAAT1和Hoechst 33258（绿色表达和蓝色表达，H）；EAAT1（绿色，I）。相差显微镜图像（J）；EAAT2和Hoechst 33258（绿色表达和蓝色表达，K）；EAAT2（绿色，L）。比例尺=150 µm。

四、结论

诱导多能干细胞（iPSCs）在临床和研究应用中日益重要的地位源于其独特的分化能力，即能够分化成人体内所有体细胞类型。成功分化成特定谱系（例如星形胶质细胞）取决于在培养过程中维持其多能性并实现均一且可重复的分化。使用含有高纯度活性生长因子的优化培养基对于实现提效、高质量的分化和获得理想的结果很重要。

本应用说明中的数据表明，Qkine提供的高纯度、非动物源性生长因子——包括EGF (Qk011)、Noggin(Qk034)、FGF2-G3(Qk052) 和CNTF(Qk063)——能够有效且可靠地诱导iPSCs分化为星形胶质细胞。这些生长因子可降低实验变异性并提高可重复性，这对于科研和治疗应用都很重要。

免疫细胞化学证实了星形胶质细胞的存在，并显示关键标记物的表达。在分化前使用无需周末的培养系统，该系统采用耐热的FGF-2(Qk052)，并配合使用不含动物源性的玻连蛋白 (Qk120) 和TGF-β1(Qk010)，进一步促进了集落形态的一致性，并降低了操作误差。有关此过程的更多信息，请参阅我们的《无需周末的人类诱导多能干细胞培养指南》。这项工作强调了高质量试剂在克服iPSC分化相关挑战（例如细胞性能不稳定或结果差异）方面的重要性。通过使用Qkine公司提供的定义明确的、不含动物源性的生长因子产品组合，研究人员可以提高复杂、长期细胞培养的可重复性，并推进其在再生医学、药物研发和疾病建模等领域的应用。

参考文献

[1] Emdad L, D’Souza SL, Kothari HP, Qadeer ZA, Germano IM. Efficient differentiation of human embryonic and induced pluripotent stem cells into functional astrocytes. Stem Cells Dev. 2012 Feb 10;21(3):404-10. doi: 10.1089/scd.2010.0560.

[2] Stoklund Dittlau, K.; Freude, K. Astrocytes: The Stars in Neurodegeneration? Biomolecules 2024, 14, 289. https://doi.org/10.3390/biom14030289.

[3] Jovanovic VM, Weber C, Slamecka J et al. A defined roadmap of radial glia and astrocyte differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2023 Aug 8;18(8):1701-1720. doi: 10.1016/j.stemcr.2023.06.007.

[4] Tcw J, Wang M, Pimenova AA, Bowles KR et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 2017 Aug 8;9(2):600-614. doi: 10.1016/j.stemcr.2017.06.018.

[5] Voulgaris, D., Nikolakopoulou, P. & Herland, A. Generation of Human iPSC-Derived Astrocytes with a mature star-shaped phenotype for CNS modeling. Stem Cell Rev and Rep 18, 2494–2512 (2022). https://doi.org/10.1007/s12015-022-10376-2.