一、前言（原文资料可联系上海曼博生物获取）

利用诱导多能干细胞（iPSCs）生成多巴胺能神经元的能力，在科研和治疗领域都具有较大潜力。iPSC衍生的多巴胺能神经元为研究帕金森病等神经退行性疾病以及精神分裂症等精神疾病中多巴胺信号传导失调的机制提供了一个宝贵的模型。随着研究的深入，这些发现有望转化为临床应用，从而对患者护理和疾病管理产生变革性的影响。

将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为多巴胺能神经元需要特定的条件才能获得所需的细胞类型。本应用说明将介绍我们使用多种培养基，并在关键分化步骤的不同阶段添加一系列Qkine生长因子和细胞因子补充剂（Qkine有多巴胺能神经元分化套装，Qk517），从而将人iPSCs分化为功能性多巴胺能神经元的方法。

二、介绍

多巴胺能神经元是负责合成、储存和释放神经递质多巴胺的特殊神经细胞。这些神经元在多种重要的脑功能中发挥着关键作用，包括运动控制、奖赏、动机和情绪调节[1]。多巴胺能神经元主要位于大脑的黑质和腹侧被盖区。它们投射到包括纹状体、前额叶皮层和边缘系统在内的多个脑区，形成复杂的神经网络，影响着多种行为和生理过程[2]。

多巴胺能神经元对运动控制十分重要，帕金森病中多巴胺能神经元的退化便证明了这一点。帕金森病是一种以震颤、僵硬和运动迟缓等运动症状为特征的疾病。在精神疾病中，多巴胺能信号传导失调也与疾病密切相关。例如，多巴胺能通路过度活跃与精神分裂症的阳性症状相关，而多巴胺功能减弱则与抑郁症中的快感缺失和动力不足有关[2]。将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为多巴胺能神经元是具有重要意义的研究领域，有望用于治疗神经系统疾病，尤其是帕金森病。

三、方法

1、细胞培养与维护

将人诱导多能干细胞 (iPSCs) 培养于E8样培养基中，置于预先包被玻连蛋白Qk120 (5 µg/ml) 的6孔板中，并采用Qkine周末免换液的培养方式。每3-4天使用0.5 µM EDTA进行传代，并以1:6的比例进行分样，以确保在开始分化过程前获得高质量的iPSCs。

2、诱导多能干细胞分化为中脑特异性底板祖细胞

当iPSCs达到所需的汇合度和质量后，使用Accutase进行传代，并以3.8× 10⁵个细胞/毫升的密度接种到 Geltrex 包被的 24 孔板中。然后让它们贴壁，直到达到 90-100% 的汇合度，形成单层细胞。

3、神经诱导和多巴胺能特化

首先使用SB431542通过双重SMAD抑制将iPSCs引导至神经祖细胞 (NPCs)，SB431542可抑制维持多能性的通路，并利用成纤维细胞生长因子8 (FGF-8a，Qk059) 等关键分子促进神经分化，从而发育为多巴胺能神经元，而FGF-8对中脑多巴胺能神经元的特化很重要。

4、成熟与维持

最后阶段涉及这些细胞成熟为功能性多巴胺能神经元（图1），这可以通过脑源性神经营养因子（BDNF，Qk050）、胶质细胞系衍生神经营养因子（GDNF，Qk051）和转化生长因子β3（TGF-β3，Qk054）等因子来支持。

图1. 第20天，中脑定向的底板祖细胞正在分化形成底板球状体，图示为球状体分离传代前的成熟阶段（比例尺=300 µm）。

第1天：使用Induction Media 1更换培养液。

第2-3天：使用Induction Media 2更换培养液。

第4-5天：使用Induction Media 3更换培养液。

第6-7天：使用Induction Media 4更换培养液。

第8-9天：使用Induction Media 5更换培养液。

第10-11天：使用Induction Media 6更换培养液。

第12-13天：使用Induction Media 7更换培养液。

第14-19天：使用Maturation Media更换培养液。

第20天：底板球状体的分离与传代

细胞使用Accutase和Papain的组合进行传代以将其分离，然后用含有DNase I的DMEM/F-12培养基进行洗涤和过滤。之后，再次仅用DMEM/F-12进行洗涤和过滤。最后，细胞以8.645 x 10^5个细胞/毫升的密度接种到涂有Geltrex的24孔板中，并加入Seeding Media。

第21–30天、第32天和第34天：使用Maturation Media更换培养液

培养基按第14–19天所制备的方法配制。

四、结果

在第35天，可以观察到成熟的多巴胺能神经元（图2）。

图2. 第35天分化成熟的多巴胺能神经元（左：比例尺=750 µM；右：比例尺=300 µM）。

五、结论

将诱导多能干细胞分化为多巴胺能神经元是推进再生医学和神经科学发展的重要工具。可靠地获得持续的高质量结果，有助于我们深入了解调控神经发育和退化的基本过程，并为帕金森病等神经退行性疾病的创新疗法研发奠定基础。

本应用说明中提供的数据表明，使用 Qkine无动物来源的生长因子FGF-8a（Qk059）、BDNF（Qk050）、GDNF（Qk051）和 TGF-β3（Qk054）可以支持iPSCs在35天内分化为成熟的多巴胺能神经元。

更多信息

Qkine生长因子按照高质量标准生产，不含动物源性污染物，具有低内毒性和高纯度。Qkine致力于提高生长因子、细胞因子和相关蛋白的标准，以更好地支持长期复杂的细胞培养。

上海曼博生物医药科技有限公司是Qkine正式授权的代理商，如有细胞因子相关疑问或需求，请联系我们。

参考文献

[1] O Klein, M. et al. Dopamine: Functions, Signaling, and Association with Neurological Diseases. Cellular and Molecular Neurobiology. 2019 Jan;39(1):31-59. doi: 10.1007/s10571-018-0632-3

[2] Zhuang, Y. et al. Mechanism of dopamine binding and allosteric modulation of the human D1 dopamine receptor. Cell Research 2021 May;31(5):593-596. doi.org/10.1038/s41422-021-00482-0