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英国Nuclera公司的eProtein Discovery是一个无细胞蛋白质合成（CFPS）系统，也被称作体外转录/翻译系统，能够实现蛋白质的快速原型设计。该系统采用数字微流控芯片和定制试剂，可针对多达192种条件筛选蛋白质表达与可溶性，包括在8种无细胞表达条件下对至多24种构建体的筛选。可在48小时内完成从DNA到蛋白质筛选与放大生产。

使用eProtein Discovery系统快速无细胞表达和纯化B淋巴细胞抗原CD19

一、引言

B 淋巴细胞抗原CD19是一种跨膜糖蛋白，为B细胞恶性肿瘤生物标志物、CAR - T等疗法理想靶点，包含单个跨膜螺旋（292-313）、天然信号肽（1-20）、胞外N端结构域（ECD）和胞内C端结构域（ICD）。其ECD有两个通过二硫键连接的免疫球蛋白样C2型结构域，ICD有多个无序区域。生产CD19，尤其是ECD对开发新的B细胞淋巴瘤治疗方法十分重要。然而，ECD素来有“难表达”的特点，会导致表达滴度低、蛋白质错误折叠和聚集，阻碍了对细胞表面分子的详细分子研究。

在本应用中，我们利用eProtein Discovery系统的可溶性标签选择功能和无细胞混合物，在24小时内筛选了192种表达条件，优化了可溶性CD19蛋白的生产（如图1所示）。我们成功表达并纯化了全长CD19、ECD和ICD。筛选完成后，在24小时内将适合条件进行放大，可生产微克级的蛋白质，从而实现了治疗研究所需复杂蛋白质的提效生产。本应用为表达其他具有跨膜结构域、二硫键和高度无序区域的“难表达”蛋白质提供了参考。

二、eProtein Discovery工作流程

eProtein Discovery系统利用无细胞蛋白质合成技术，可快速筛选蛋白质构建体并放大生产复杂蛋白质（图1）。

图1. eProtein Discovery工作流程。从DNA到可溶性蛋白只需48小时。

在本研究中，选择了三种CD19长度变体：全长CD19（CD19_21-556）、N端截短体（CD19_21-277）和C端截短体（CD19_327-556）。这两种截短体均去除了CD19的跨膜区域。此外，全长和N端截短体均省略了初始信号肽序列（0-20）。这些变体被输入eProtein Discovery软件并进行密码子优化，随后添加3C和TEV侧翼序列。使用可溶性筛选构建体试剂盒生成包含不同可溶性标签的表达构建体，以及一个不含可溶性标签的构建体。每个构建体的C端均整合了用于磁珠纯化的Strep标签和用于表达纯化后蛋白质定量的检测标签（图2A）。

图2. 实验筛选条件。（A）为三种CD19长度变体生成的带有可溶性标签的 eGene 构建体。

在制备eGene构建体后，向8种包含无细胞核心试剂的无细胞混合物中添加各种添加剂，包括分子伴侣（DnaK）、二硫键促进剂（PDI+/GSSG）和可溶性标签切割酶（3C蛋白酶）（图2B）。

图2. 实验筛选条件。（B）用于提高可溶性蛋白产量的无细胞混合物选择。

将24种eGene构建体和8种无细胞混合物与纯化磁珠、对照/空白样品和缓冲液一起加样到卡盒上。这种利用eProtein Discovery系统的设置，促进了192种表达谱的自动生成和分析。每种CD19变体表达最高的10种eGene/无细胞混合物组合会被自动选择用于纯化，并完成蛋白质检测以确定预测的放大产量，所有这些都在24小时内完成。

对于每种CD19变体，将预测产量至高的表达方案第二天进行放大生产，并使用放大试剂盒进行纯化，以生产微克级的蛋白质。蛋白质纯度和产量通过SDS-PAGE和荧光测定法进行定量分析。

三、结果

eProtein Discovery系统成功表达并纯化了全长CD19蛋白及其截短变体，证明了其强大的性能（见图 3）。该系统用于快速筛选192种表达条件，并在24小时内获得30个可纯化性数据点，以确定生产可溶性CD19蛋白变体的最佳条件（图 3A 和 3B）。

图3. 筛选结果。（A）每种eGene构建体与无细胞混合物组合的表达产量。

图3. 筛选结果。（B）每种CD19长度变体表达量至高的 10 种组合经纯化后确定纯化浓度。

在三种CD19变体中，N端胞外结构域（CD19_21-277）的蛋白产量更高，预测产量达29.68 μg/200 μL（图 3C）。

图3. 筛选结果。（C）200μL放大体系的预测产量。

引入可溶性标签（尤其FH8标签）使CD19总产量显著提升32% ；无细胞混合物中添加PDI+/GSSG可促进二硫键形成，提升ECD表达量，混合物4与FH8标签联用预测产量更高，混合物3则兼具高产量与标签切除灵活性。该系统成功筛选出生产可溶性全长CD19的条件，产量4.29 μg/200 μL，混合物3表现优，体现优化蛋白生产的多功能性与精准性，不过全长CD19产量仍需优化。无细胞系统有效降低了天然系统中无序蛋白常见的蛋白酶降解风险，同时通过可溶性标签和添加剂的使用减少不溶性聚集物的产生。这一能力使得该挑战性蛋白得以成功表达和纯化。

在筛选192种表达条件并纯化30种以确定预测产量后，每种CD19变体的合适条件被放大，在24小时内生产出微克级蛋白用于下游应用。SDS-PAGE分析证实所有CD19变体均成功表达，其中N端ECD纯度达88%，C端胞内结构域纯度达100%，但全长蛋白纯度较低（图4A）。通过内部荧光测定和SDS-PAGE进行的蛋白产量定量与预测产量高度吻合，证明了该系统从筛选到放大的可靠性（图4B）。总体结果证实了eProtein Discovery系统在明显加速高质量复杂蛋白生产方面的有效性和精确性。

图4. CD19放大生产结果。（A）使用优化后的eGene/无细胞混合物在200 µL体系中表达并纯化的CD19长度变体的SDS-PAGE分析（FT=流出液）。

图4. CD19放大生产结果。（B）通过内部荧光测定和SDS-PAGE确定的蛋白产量与系统预测产量的对比。

四、结论

通过同步测试不同CD19蛋白构建序列、可溶性标签及蛋白表达参数，eProtein Discovery可在24小时内快速确定合适的蛋白表达条件，并在48小时内获得目标蛋白。这一能力使研究人员能够快速开展蛋白靶点鉴定及疾病机制相关蛋白的验证工作。该系统整合数字微流控技术、蛋白质质量分析及无细胞蛋白合成技术，即使对于最难表达的蛋白质也能实现快速制备，从而大幅简化了治疗性研究与开发的流程。

KEY英国Nuclera公司由剑桥大学的博士生们于2013年创立。在撰写论文期间，他们发现蛋白质难以获取的问题是生物学领域的重要障碍和瓶颈。他们着手解决蛋白质难以获取的问题，以期改善人类健康状况。公司的愿景是打造出从DNA到蛋白质的原型设计系统，以减少在药物发现计划中获得靶蛋白的时间和障碍。

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