无细胞抗体表达×SpyBLI——从基因片段到结合动力学数据

剑桥大学 RSC Chemical Biology 论文揭示抗体工程“验证”环节的新范式——eProtein Discovery 无细胞表达 × SpyBLI 共价捕获，无需纯化、无需测浓度，直接从未纯化样品读取 KD、kon、koff。

设计的瓶颈，从来不在设计，而在验证

抗体工程与蛋白设计的节奏，正在被 AI 与下一代测序（NGS）改写。如今，一轮计算设计、一次噬菌体展示或酵母展示库的高通量测序，动辄就能产出几十甚至上百个候选结合蛋白。真正拖慢研发进程的，往往是紧随其后的验证环节——为了给每一个候选测一个准确的结合动力学（平衡解离常数 KD、结合速率 kon、解离速率 koff），传统的 SPR/BLI 流程要求把每个分子都纯化出来、测定浓度、再做精密的配体固定。一个分子动辄耗费数天到数周，成了压在研发周期上的一块隐形天花板。

设计可以一天迭代几百次，验证却要等上几周——这个错位，正是当下抗体与结合蛋白工程的真实痛点。

剑桥大学的答案：SpyBLI

针对这一瓶颈，剑桥大学 PietroSormanni 团队在国际期刊 RSC Chemical Biology 上发表了一种名为 SpyBLI 的新方法，用一个“共价捕获”的巧思，把整套流程大幅简化。

方法的灵感来自 SpyCatcher003–SpyTag003 这对“分子胶水”——它们能通过异肽键实现快速、特异且不可逆的共价连接。SpyBLI 正是借助这一特性，把带有 SpyTag 标签的结合蛋白定向、均匀地捕获到 BLI 生物传感器上，从而一举解决了传统方法的三大难题：

1. 无需纯化：直接从未纯化的哺乳细胞上清、或无细胞表达混合液中读数，省去层析纯化的漫长流程；
2. 无需测浓度：共价捕获天然绕开了“粗样品中配体浓度未知”这一经典难题，不再需要额外的定量实验；
3. 定向固定：所有分子统一朝向排列，告别随机取向带来的表面异质性与传质假象，数据质量大幅提升。

eProtein Discovery：让造蛋白的速度跟上测蛋白的速度

一套方法能否真正落地，关键还在于能否稳定、快速地造出这些结合蛋白。这正是 Nuclera eProtein Discovery 无细胞系统（点击查看）大显身手的地方。

论文团队面临的是一类棘手的目标：部分纳米抗体含有非经典二硫键，它们对 CDR3 构象的稳定十分关键，但大肠杆菌无细胞体系偏还原的胞质环境会阻碍二硫键的正确形成。团队利用 eProtein Discovery 系统，在 24 小时内并行筛选了 24 个构建体×8 种无细胞反应体系（共 192 种条件），系统性地比较可溶性标签与各类氧化还原等添加剂（PDI、GSSG、TrxB1、DnaK 分子伴侣组合等）的组合效果，从而锁定理想表达条件——去除可溶性标签、强化氧化还原环境，明显提升了所有测试蛋白的可溶产量。12 个抗体片段随后被成功表达纯化，并经质谱确认二硫键正确形成。

正是这一步“自动化高通量的蛋白表达条件优化”，让“从线性基因片段到可直接用于动力学测量的蛋白”变得可靠、快速且几乎零手工操作。

硬核数据：跨度六个数量级，结果跨体系保持一致

用这套方法，团队验证了它惊人的适用范围与稳健性：

表1.SpyBLI 联合无细胞表达系统的性能验证结果

更关键的是，无细胞表达的抗体片段，其测得的结合动力学与哺乳细胞表达、甚至与经亲和层析+分子排阻纯化的样品完全可比。这意味着，eProtein Discovery 系统提供的无细胞产物，在能否用于高精度动力学表这一严苛的判据上，经得起检验。

谁更需要这套工作流？

1. 计算蛋白设计/AI 抗体设计团队——获得快速、准确的实验反馈，让“设计-测试-优化”迭代真正转起来；
2. NGS 抗体库与展示库筛选——对成百上千的测序命中候选进行高通量动力学初筛，快速锁定高亲和力分子；
3. 双抗/多特异性抗体早期开发——在投入昂贵纯化之前，先完成候选的亲和力与动力学排序；
4. 含二硫键纳米抗体/单链抗体的表征——攻克氧化还原依赖型分子的表达与折叠难题。

结语：把验证也提速到天级

当设计被 AI 加速到小时级，验证也必须跟上节奏。SpyBLI 与 eProtein Discovery 的组合，把过去“克隆—表达—纯化—测动力学”这条耗时数周的长流程，压缩成了一个天级循环——没有克隆、没有 PCR、没有纯化、没有浓度测定。对于任何想在抗体工程与结合蛋白研发赛道上跑得更快的团队，这都是一套值得立刻放进工具箱的答案。

参考文献

拓展阅读