诱导性多能干细胞 (iPSC) 分化为神经外胚层

iPSC向三胚层分化系列,将分别介绍诱导多能干细胞（iPSCs）分化为外胚层、中胚层和内胚层谱系过程的Protocol，本期将重点讨论将 iPSC 分化为神经外胚层细胞的Protocol。

无饲养层人类诱导多能干细胞 (iPSC) 分化为神经外胚层细胞是一个复杂的过程，需要使用 noggin 和 FGF2 等生长因子。此外，还需要使用激活素受体样激酶受体阻断剂 SB431542 等因子来提高分化效率并稳定神经外胚层命运。这种组合使研究人员能够可靠地生成功能性神经外胚层细胞用于各种生物医学应用。在本应用说明中，我们概述了使用含有QKine的重组 FGF2 家族成员（如 Qkine FGF2-G3 (Qk053)）和 noggin(Qk034）的培养基将iPSC分化为神经外胚层细胞的方法。神经外胚层标志物表达用于通过免疫细胞化学评估成功分化。

01   介绍

iPSCs是一种体外模型，代表了再生医学和细胞生物学领域的重大突破。通过重编程，iPSCs具备了分化为三胚层（外胚层、中胚层和内胚层）中任意细胞类型的能力。这为疾病建模、药物发现和基于细胞的治疗提供了较大潜力，并且不涉及使用胚胎干细胞的伦理问题[1]。

鉴于外胚层在生成中枢和周围神经系统、感觉器官和皮肤方面的作用，将iPSC分化为外胚层谱系尤为重要[2]。将iPSC分化为神经外胚层细胞，然后进一步分化为外胚层谱系，对于研究神经发育过程、模拟神经系统疾病以及开发影响神经系统和皮肤的疾病的潜在疗法十分重要。

iPSC分化为神经外胚层细胞通常涉及在体外模拟胚胎发育阶段。在早期胚胎发生过程中，神经外胚层的形成是通过抑制几种信号通路来启动的，例如使用SB431542等小分子抑制剂抑制TGF-β通路，以及使用noggin等BMP抑制剂抑制骨形态发生蛋白(BMP)通路，这模拟了神经板形成过程中发生的BMP自然抑制[3]。

iPSC成功分化为神经外胚层细胞并非没有挑战。由于iPSC系内存在差异，分化效率以及不完全或混合谱系分化的可能性是研究人员继续解决的重大障碍。可以通过研究SRY-box转录因子1(SOX1)和SRY-box转录因子2(SOX2)等标记物的表达来评估成功率[4]。

02   材料和方法

1.细胞培养和维护

每周使用 0.5 mM EDTA 传代两次 iPSC 以分离，然后以 1:6 的分流比接种在玻璃粘连蛋白vitronectin ( Qkine，Qk120 ) (5 µg/ml) 包被的 6 孔板中，并在 E8 类培养基中培养。传代后的第二天，去除用过的培养基，用 5 ml E8 类培养基替换，使细胞遵循周末无培养基更换模式。有关此过程的更多信息，使用Qkine的耐热 FGF-2 (bFGF)以及我们的无动物来源TGF-β1和玻璃粘连蛋白进行周末无人类诱导多能干细胞培养，以提高菌落同质性。

2.iPSC 分化为神经外胚层

神经外胚层分化工作流程示意图（图 1）概述了 iPSC 分化为神经外胚层的步骤以及通过测试神经外胚层表达标记来评估分化的步骤。

图1.神经外胚层分化和评估测试时间表

使用Accutase分离iPSC ，并以1,000个细胞/孔的密度接种在涂有vitronectin (Qk120) (5 µg/ml) 的 96 孔板中，该板中的 E8 类培养基含有 ROCK 抑制剂 (Y-27632, 10 µM)。第二天 (第1天) 以及直到第 10 天的每一天，细胞都用外胚层培养基喂养 (表1)。

表1.日常神经外胚层培养基配制成分，各成分在使用前无菌添加

表2.CDM-PVA培养基配制成分，各成分无菌添加，并在使用前过滤培养基

3.免疫细胞化学

在第10天，细胞用4%多聚甲醛固定，并用10%驴血清（稀释在0.1% Triton X-100中）进行封闭和透化。

针对外胚层标志物SOX1和SOX2的特异性抗体被用于免疫染色，并在4°C下孵育过夜。然后，将iPSCs洗涤后与二抗（Donkey anti-Goat AlexaFluor 488）和Hoechst 33258孵育，最后在磷酸盐缓冲液中进行成像。

图2. 分化 iPSC 中神经外胚层标志物的免疫细胞化学。SRY -box 转录因子 1 (SOX1) [绿色，A]、Hoechst 33258 [蓝色，B]、SOX1 和 Hoechst 的组合 [C] 和 SRY-box 转录因子 2 (SOX2) [绿色，D]、Hoechst33258 [蓝色，E]、SOX2 和 Hoechst 的组合 [F]。图像是使用 EVOS M5000 系统获取的（比例尺 = 300 µm）。

03   结论

由于 iPSC 具有分化成人体所有体细胞类型的潜力，其在临床和研究领域的重要性日益增加。iPSC 成功分化为所需细胞类型（如神经外胚层细胞）依赖于在培养过程中保持 iPSC 的多能性以及同质分化。因此，使用含有高纯度生物活性生长因子的正确培养基对于实现此目的的可重复性十分重要。

本应用说明中提供的数据表明，使用 Qkine FGF2-G3（Qk053）和 Qkine noggin (Qk034).支持 iPSC 分化为神经外胚层。

参考文献

[1] Varum, S. et al. Energy Metabolism in Human pluripotent stem cells and their differentiated counterparts. PLoS ONE. 2011;6(6):e20914. doi: 10.1371/journal.pone.0020914

[2] Tchieu, J. et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 2017 Sep 7;21(3):399-410.e7. doi: 10.1016/j.stem.2017.08.015

[3] Smith, J. R. et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 2008 Jan 1;313(1):107-17. doi: 10.1016/j.ydbio.2007.10.003

[4] Galiakberova, A. A. et al. Neural Stem Cells and Methods for Their Generation From Induced Pluripotent Stem Cells in vitro. Frontiers in cell and developmental biology. 2020 Oct 8:8:815. doi: 10.3389/fcell.2020.00815

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