GPCR无细胞表达与纳米盘筛选：72小时获得功能性β1AR

G蛋白偶联受体（GPCR）是35%获批药物的靶点，但已解析结构的受体数量很少，主要难点在于传统去垢剂体系难以获得稳定、有功能的样品。去垢剂会剥离保护性脂质，导致蛋白聚集、配体结合能力下降，往往需要数周反复优化才能满足实验需求。

无细胞蛋白合成（CFPS）技术可有效解决这一问题，能避免细胞毒性并实现膜蛋白共翻译整合。在体系中加入预组装的脂质纳米盘后，新合成的GPCR可直接插入近天然的脂双层环境中。这种无需去垢剂、“合成即稳定”的策略能够保留关键的脂质-蛋白相互作用，并支持对可调控设计参数（支架尺寸、脂质组成）进行快速筛选优化，大幅提升蛋白表达量与功能性折叠效率。

图1.无细胞蛋白合成体系可在翻译过程中实现GPCR向特定脂质环境的共翻译插入。

eProtein Discovery GPCR纳米盘筛选试剂盒通过优化膜支架蛋白尺寸与脂质组分，结合自动化数字微流控快速平行筛选，可在短时间内确定GPCR理想的表达条件并获得可直接用于实验的活性蛋白。

图2.eProtein Discovery无细胞蛋白表达筛选系统工作流程。

本应用展示了一套快速制备高活性热稳定截短型火鸡 β1肾上腺素能受体（ttsΔβ1AR）的实验流程。借助eProtein Discovery微流控无细胞蛋白表达技术，高通量筛选并确定了理想脂质组成方案，相较于通用脂质体系可使受体的功能性配体结合活性提升3倍。目标受体放大表达后，通过尺寸排阻色谱（SEC）精制将活性单体比例富集至约45%，从而实现了在72小时内获得了可满足结构解析要求的高纯度ttsΔβ1AR。

一、GPCR无细胞筛选β1AR制备方法

1. 序列设计与DNA制备

人源全长β1肾上腺素能受体（hβ1AR）、人源全长热稳定型β1肾上腺素能受体（htsβ1AR）及热稳定截短型火鸡 β1肾上腺素能受体（ttsΔβ1AR）的表达构建体均基于Kock等人与Rues等人的前期研究进行设计。分别在受体序列的N端与C端引入3C酶切位点与TEV酶切位点接头序列，随后通过eGene FlexiVariant试剂盒将目标序列组装为适配eProtein Discovery系统的线性DNA模板。

2. eProtein Discovery无细胞蛋白表达筛选

采用eProtein Discovery系统及微流控芯片，对3种β1AR变体与8组无细胞反应体系进行自动化多重筛选。每种体系包含无细胞表达试剂、PDI/GSSG氧化还原混合液，以及预组装纳米盘或缓冲液对照。共测试7种纳米盘：其中4种来自GPCR纳米盘筛选试剂盒，3种为通用型纳米盘（表1）。其余表达与纯化试剂均采用膜蛋白专用试剂盒配套试剂。

表1.用于eProtein Discovery多重筛选的8组无细胞反应体系。

3. 放大表达

参照优化方案进行放大表达：用于初步LAC分析时，构建含DNA构建体、无细胞表达试剂、PDI/GSSG以及MSP1E3D1纳米盘等的反应体系，29℃过夜孵育，经链霉亲和素磁珠纯化后，对粗产物和洗脱液进行SDS-PAGE分析；用于制备型SEC时，构建3mL反应体系并分为1mL等分孵育，加入RNase A处理后纯化、合并洗脱液并浓缩，蛋白产量采用eProtein定量试剂盒测定。

4. 制备型SEC与SE-UHPLC

将浓缩的ttsΔβ1AR放大样品上样至经SEC运行缓冲液预平衡的Superdex 200 Increase 10/300凝胶过滤柱，收集各峰组分并浓缩至约50μL，速冻后于-80℃保存。

采用Waters ACQUITY Premier系统对SEC组分进行分析型SE-UHPLC验证。取10μL过滤样品上样至蛋白SEC色谱柱，柱温25℃、样品室4℃；以含磷酸氢二钠、NaCl和精氨酸的缓冲液（pH7.5）为流动相，0.4mL/min流速运行8min，通过色氨酸荧光检测蛋白洗脱。

5. 配体亲和层析

取7.5μg纯化的ttsΔβ1AR，与20μL预平衡的琼脂糖树脂于微型离心柱中4℃孵育2小时。

用洗涤缓冲液洗涤树脂3次，加入含异丙肾上腺素的洗脱缓冲液室温孵育2小时后离心洗脱活性受体。采用eProtein定量试剂盒测定蛋白浓度，并通过比较层析前后蛋白量计算结合率。

二、GPCR无细胞筛选β1AR实验结果

1. 24小时高通量筛选降低GPCR制备风险

使用eProtein Discovery无细胞蛋白表达筛选系统，可在24小时内完成3种β1AR变体在8组无细胞混合体系中的表达与纯化产量分析。该步骤可快速确定能有效表达蛋白的载体与条件组合，降低GPCR制备流程风险。如图3所示，带负电的纳米盘（DOPG、DMPG）在所有β1AR变体中均获得较大纯化产量。其中ttsΔβ1AR变体纯化浓度可达约5μM，因此被选用于放大制备与功能表征。

图3.eProtein Discovery筛选结果。

2. 从筛选到放大：纯化ttsΔβ1AR浓度约100μg/mL

在6种筛选出的纳米盘条件下对ttsΔβ1AR进行过夜放大表达，可成功获得约100μg/mL的纯化受体。与筛选结果一致，MSP1E3D1‑DOPG和MSP1E3D1‑DMPG纳米盘组总蛋白产量高（图4A）。SDS‑PAGE结果证实ttsΔβ1AR在目标分子量处成功表达（图4B）。

图4.ttsΔβ1AR放大制备结果。(A)ttsΔβ1AR在6种不同MSP-脂质组分体系中的放大纯化产量；(B)ttsΔβ1AR在3种体系中放大表达后的电泳图。

3. nuclera GPCR纳米盘使受体活性提升3倍

eProtein Discovery系统可准确预测蛋白产量并指导放大，但产量高并不代表受体有功能，而脂质组成对GPCR活性构象影响很大。研究通过配体亲和层析（LAC）测定放大后样品的结合率（图5A）。结果表明，受体功能明显依赖脂质类型，eProtein Discovery GPCR纳米盘效果更优。在DOPG、POPC/POPS、POPC/POPS/胆固醇体系中，ttsΔβ1AR的功能结合率是DMPG体系的3倍（图5B），而POPC体系表达的ttsΔβ1AR无活性。

图5.配体结合初步研究。(A)配体亲和层析（LAC）示意图；(B)ttsΔβ1AR在6种不同MSP-脂质组分中的结合率。

Nuclera的GPCR专用纳米盘凭借合理的脂质设计，通过不饱和、带合适电荷比例的脂质组分提供了适配GPCR的柔性天然膜环境，大幅提升了β1AR活性，远优于饱和脂质或纯中性脂质体系。

4. SEC精制将单体配体结合活性组分富集至45%

选用活性与产量优的DOPG体系表达的ttsΔβ1AR进行制备型SEC精制，分离去除聚集体与错误组装蛋白，得到单体目标复合物；经检测，峰3活性结合率达45%，较初始纯化提升3倍，可用于后续结构和功能研究。

图6.ttsΔβ1AR样品质量富集。(A)MSP1E3D1-DOPG体系表达产物的SEC图谱；(B)各SEC组分的分析型SE-UHPLC结果；(C)LAC结合分析显示峰3活性组分提升3倍。

三、无细胞筛选在GPCR制备中的应用总结

eProtein Discovery系统工作流程将膜蛋白迭代优化周期从数月缩短至数天。采用快速自动化无细胞蛋白表达筛选，替代了耗时的细胞宿主构建和去垢剂筛选，可在72小时内获得活性GPCR蛋白。

该系统能高通量筛选DNA构建体与纳米盘组合，快速确定高产优质条件，相比普通脂质配方，其功能配体结合活性提升3倍。这种自动化筛选与近天然纳米盘体系，为结构生物学和药物靶点发现提供了稳定的高质量受体样品制备方案。

上海曼博生物（MineBio）为英国nuclera品牌在中国地区的官方供应商，专注无细胞蛋白表达等前沿技术在生命科学研究中的应用。更多技术信息可参考：曼博生物提供nuclera eProtein Discovery无细胞蛋白表达技术支持（https://www.mine-bio.com/nuclera/）。

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