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发布时间：2026/04/24 点击数：14 eProtein Discovery无细胞系统搭配多种添加剂定制无细胞蛋白表达条件以获得活性蛋白质
本文摘要：本应用笔记提供了无细胞蛋白表达的详细案例，展示了辅因子、氧化还原调节剂和分子伴侣对目标蛋白纯化产量及活性具有显著影响。这些案例表明，在表达过程中添加此类物质对于提高蛋白纯化产量或获得有活性蛋白十分重要，也证实了它们在蛋白质折叠与功能发挥中的重要作用。
一、无细胞系统如何进行蛋白表达与纯化筛选？
eProtein Discovery提供一套即用型添加剂组合，包含10种不同的添加剂试剂。我们已通过实验验证了这些添加剂与无细胞核心试剂的兼容性。该系统允许每种混合物最多定制两种添加剂，进而可生成多达55种独特的无细胞混合物。在一轮eProtein Discovery无细胞蛋白系统的筛选实验中，24种eGene构建体可与8种不同的无细胞混合物进行筛选组合，在24小时内生成192种独特的表达条件。借助该系统，用户能够快速确定是否需要添加辅因子、分子伴侣或氧化还原调节剂，以获得正确折叠的蛋白质、提高最终蛋白产量或增强蛋白活性。
图1展示了利用不同无细胞混合物进行蛋白表达，随后开展纯化与活性筛选的完整流程。通过在混合物中添加辅因子、分子伴侣和氧化还原调节剂构建多种组合，这一设计凸显了这些物质对蛋白纯化效率及所表达蛋白酶活性的影响。
图1：无细胞技术利用独特无细胞混合物（CFB，Cell-free Blend）进行蛋白表达，随后开展蛋白纯化与筛选的工作流程。
本实验所用模型蛋白均在添加了辅因子、分子伴侣和氧化还原调节剂的无细胞混合物中表达，以此验证添加剂对后续蛋白纯化产量及酶活性的影响。
二、eProtein Discovery无细胞系统添加剂试剂盒
我们精心挑选了10种添加剂纳入eProtein Discovery添加剂组合中，这些添加剂对保障蛋白质正确折叠及维持活性十分重要。表1汇总了各添加剂选项及其对蛋白质折叠的益处。这份全面的添加剂清单涵盖了大多数蛋白表达需求，既包括营造有利于二硫键形成的环境，也包括添加分子伴侣、辅因子或金属离子等额外成分以促进蛋白正确折叠。此外，通过添加 3C 蛋白酶，还可实现对可溶性标签去除效果的评估。
表1：添加剂选项及其在蛋白表达中的益处。
三、无细胞技术添加剂方案选择
在开展实验前，用户需考虑目标蛋白可能存在的需求，以及为获得正确折叠、可溶解的蛋白质所需添加的添加剂。用户可参考图 2 中的决策树，以此为指引选择合适的添加剂。
图2：指导用户选择添加剂的决策树。每种表达用无细胞混合物中最多可添加两种添加剂。
所提供的案例可用于指导用户根据自身独特的蛋白表达需求选择添加剂，进而快速制备高质量、可溶解且具有活性的蛋白质，以满足下游应用需求。
3.1 金属离子
据估计，生物体中 25%-50% 的蛋白质都含有金属离子。这些金属蛋白承担着多种关键生理功能，包括呼吸作用、光合作用、DNA 合成，甚至蛋白质合成本身。与蛋白质结合的金属离子发挥着基础的结构支撑、调控及酶学作用，对蛋白质的正确折叠与功能发挥至关重要。在所有酶中，16% 的酶会结合锌离子，使其成为最常用的金属离子辅因子。
案例1：锌离子（Zn²⁺）是活性金属蛋白酶表达的必需条件金属离子
嗜热菌蛋白酶是一种热稳定的锌金属蛋白酶，由嗜热蛋白分解芽孢杆菌分泌产生。该酶的应用场景较多：可用于人工甜味剂阿斯巴甜的生产，在肽图分析中用作非特异性蛋白酶，同时也是抗高血压药物研发过程中的重要作用机制模型。锌离子是嗜热菌蛋白酶发挥催化活性的必需物质，此外该酶还能结合四个钙离子，这些钙离子被认为有助于增强其热稳定性。
研究人员使用Nuclera的eGene制备试剂盒构建了线性、无标签的嗜热菌蛋白酶表达构建体，并结合Nuclera的筛选和放大试剂盒，分别在不同条件下表达嗜热菌蛋白酶。为了单独分析这些金属离子在表达阶段的作用，所有实验组的蛋白纯化过程均未添加金属离子添加剂（图 3A）。
通过荧光蛋白酶活性测定法检测各纯化蛋白的活性：蛋白酶催化荧光标记的蛋白底物水解后，会解除底物的荧光淬灭状态，产生的荧光信号强度与蛋白酶活性呈直接正相关。实验结果与已发表文献一致：嗜热菌蛋白酶的活性依赖于表达过程中锌离子的存在，而与钙离子无关（图 3B）；即使将钙离子与锌离子联合添加，也未观察到酶活性的进一步提升，这可能是因为实验未设置高温条件对酶进行热应激挑战。这些结果证实，在表达阶段添加锌离子对于制备具有活性的锌金属蛋白酶十分重要。
图3：有无锌离子存在时所表达嗜热菌蛋白酶的活性对比。
（A）嗜热菌蛋白酶在4组不同表达条件下进行，随后所有蛋白均在相同条件下进行活性检测。（B）荧光蛋白酶活性测定结果：展示了在上述指定添加剂存在下表达后，纯化嗜热菌蛋白酶的活性水平。所有活性检测反应均使用了等量的各蛋白样品。
案例2：锰离子（Mn²⁺）作为添加剂助力活性蛋白表达
为进一步探究金属离子添加剂对蛋白质折叠环境的定制化调控作用，我们分析了Mn²⁺对人精氨酸酶-1（ARG1）的影响。ARG1是一种同源三聚体锰结合金属酶，参与精氨酸代谢过程，该酶缺乏会导致高精氨酸血症。研究人员构建了无标签和 SUMO 标签的ARG1线性表达构建体，并分别在不同条件下进行表达（图 4A）。
蛋白纯化后，通过精氨酸酶活性测定法检测其活性：ARG1催化反应生成尿素，尿素引发的颜色变化程度与酶活性呈正相关。活性检测结果显示，在表达过程中添加Mn²⁺可显著提高纯化后酶的活性（图 4B）。
图4：含Mn²⁺的无细胞混合物是ARG1获得活性的必需条件。
（A）ARG1 eGene 构建体分别在4组不同的条件下表达，所有蛋白均在相同条件下进行活性检测。（B）比色法活性测定结果：展示了纯化后ARG1的活性水平。在含Mn²⁺条件下表达的 ARG1，其活性是在不含Mn²⁺无细胞混合物中表达的ARG1的5倍。
3.2 有机辅因子
除金属离子外，小分子有机化合物也可作为蛋白质辅因子，发挥关键的结构支撑与功能调控作用。许多有机辅因子来源于维生素，例如磷酸吡哆醛（PLP）是维生素 B6 的活性形式，参与胺类物质及氨基酸代谢中的多种反应。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、乙酰辅酶 A（Acetyl-CoA）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）及磷酸吡哆醛（PLP）均被纳入辅因子混合物中，作为 Nuclera 添加剂组合的重要组成部分。
案例1：有机辅因子磷酸吡哆醛（PLP）作为添加剂，可提升蛋白纯化产量与活性
天冬氨酸转氨酶（AAT）长期以来一直被用作研究模型蛋白，用于解析磷酸吡哆醛（PLP）依赖型酶的作用机制及其在氨基酸代谢中的功能。本研究评估了含 PLP 的 “辅因子混合物” 作为添加剂，对AAT表达及纯化产量的影响。结果显示，在含 PLP 的条件下表达的 AAT，其纯化蛋白产量是不含 PLP 无细胞混合物中表达产物的 2 倍（图 5A、图 5B）。此外，通过荧光法 AAT 活性检测发现，仅在含 PLP 条件下表达的纯化 AAT 具有活性（图 5C）。这些结果证实，表达阶段添加有机辅因子 PLP，对于提升 AAT 的纯化产量及酶活性十分重要。
图5：含PLP的无细胞混合物可提升AAT的纯化产量与活性。
（A）AAT eGene 构建体分别2组不同条件下表达，随后进行蛋白纯化，所有样品均在相同条件下进行活性检测。（B）不含与含PLP条件下表达的AAT纯化产量对比。（C）荧光法活性检测结果：展示了不含与含 PLP 条件下表达的纯化 AAT 的活性水平。所有活性检测反应均使用了等量的各蛋白样品。
案例2：金属离子与有机辅因子组合作为添加剂，助力活性蛋白表达
乙醇脱氢酶 1A（ADH1A）是一种二聚体酶，依赖锌离子（Zn²⁺）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）发挥作用，参与乙醇代谢过程。本研究分别在不同的无细胞混合物中表达 ADH1A（图 6A），并通过比色法乙醇脱氢酶活性测定法检测各纯化蛋白的活性。
结果显示：与未定制化的无细胞混合物（对照组）相比，单独添加Zn²⁺或单独添加含 NAD 的辅因子混合物，均能提升纯化后 ADH1A 的活性；但仅当Zn²⁺与含 NAD 的辅因子混合物联合添加时，才能观察到最高的酶活性（图 6B）。这一结果表明，将金属离子与有机辅因子组合作为添加剂，可助力制备活性最大化的人类蛋白。
图6：含Zn²⁺与NAD的无细胞混合物是ADH1A实现活性最大化的必要条件。
（A）ADH1A eGene构建体分别在4组不同的条件下表达，随后进行蛋白纯化，所有样品均在相同条件下完成活性检测。（B）对不同条件下表达后纯化的 ADH1A 开展比色法活性测定。所有活性检测反应均使用等量的蛋白样品。
3.3 分子伴侣
即便在所需辅因子存在的条件下，部分蛋白质仍易发生错误折叠。在细胞内环境中，蛋白毒性应激与高浓度大分子物质会破坏蛋白质的稳定性，进而促进蛋白质聚集。分子伴侣的作用机制是短暂结合错误折叠蛋白通常会暴露的疏水残基，以此抑制蛋白聚集，并通过正确途径主动驱动蛋白重折叠。
DnaK（即热休克蛋白 70，HSP70）是一类主要的分子伴侣，约有 9%-18% 的新合成多肽链会与其发生相互作用。DnaK 具有 ATP 酶活性，其功能可被协同伴侣蛋白 DnaJ 和 GrpE 激活：其中 DnaJ 通过结合目标蛋白上的疏水区域发挥辅助作用，GrpE 则负责促进 ATP 与 ADP 的交换过程。
案例：分子伴侣混合物 DnaK 作为添加剂，促进蛋白正确折叠
荧光素酶因在热激条件下易发生聚集，且可通过生物发光法便捷检测其正确折叠状态与活性，长期以来一直被用作研究 DnaK 等分子伴侣重折叠机制的模型蛋白。本研究将 DnaK 混合物作为添加剂，验证其在翻译过程中对荧光素酶折叠的影响。
研究人员构建了海洋桡足类荧光素酶（GLuc）的线性表达构建体，并分别在添加和未添加 DnaK 混合物的无细胞混合物中进行蛋白表达（图 7A）。活性检测结果显示：与仅添加缓冲液的对照组相比，在含 DnaK 混合物的无细胞体系中表达的 GLuc，其活性提升了 1 倍（图 7B）。该结果证实，分子伴侣的存在可促进蛋白质正确折叠并提高其可溶性，进而提升蛋白活性。
图7：含DnaK的无细胞混合物可促进GLuc的折叠并提升其活性。
（A）GLuc分别在不含和含DnaK的条件下进行表达，随后开展蛋白纯化，所有样品均在相同条件下完成活性检测。（B）对不同条件下表达后纯化的GLuc进行发光活性测定。所有活性检测反应均使用等量的蛋白样品。
3.4 氧化还原调节剂
除辅因子与分子伴侣外，蛋白表达所处的氧化还原环境也会对其折叠与稳定性产生显著影响。这一点对于含二硫键的蛋白质尤为重要，这类蛋白质占哺乳动物蛋白质总量的四分之一。
在氧化环境中（如内质网内），相邻半胱氨酸残基的巯基会被氧化，巯基中的硫原子相互反应形成共价二硫键。但该反应过程往往容易出现错误，需要蛋白二硫键异构酶（PDI）等酶类参与重排二硫键，以确保其正确形成。二硫键的形成与正确排布，对于包括分泌酶和抗体在内的众多蛋白质的正确折叠、结构稳定及功能发挥都十分重要。
案例：GSSG与PDI组合作为添加剂，促进含二硫键蛋白正确折叠
GLuc含有5个二硫键，而这些二硫键是其实现最大生物发光活性的必需条件。因此，本研究再次选用 GLuc 作为模型蛋白，在添加了PDI与GSSG的定制化无细胞混合物中进行表达（图 8A）。
实验结果显示：与标准还原条件下的表达相比，单独添加 GSSG 即可提升 GLuc 的活性；而当 GSSG 与 PDI 联合使用时，GLuc 的活性提升幅度更为显著（图 8B）。这一结果表明，在蛋白翻译过程中定制化调控氧化还原环境，可通过促进含二硫键蛋白的正确折叠来提升其活性。此外，该实验还证实，额外补充 PDI 能够确保二硫键的正确排布，进而使蛋白活性达到最佳水平。
图8：含GSSG与PDI的无细胞混合物可促进GLuc实现最优折叠并提升活性。
（A）GLuc分别在3组不同条件下进行表达，随后开展蛋白纯化，所有样品均在相同条件下完成活性检测。（B）对不同条件下表达后纯化的 GLuc 进行发光活性测定。所有活性检测反应均使用等量的蛋白样品。
四、总结
Nuclera无细胞核心试剂与可定制化添加剂系统相结合，构建出一套高效且灵活的蛋白表达优化体系。借助eProtein Discovery系统，研究人员能够快速筛选出更优表达条件，实现高产量、高活性功能蛋白的制备，进而有力推动蛋白相关研究与应用的进程。
- 金属离子（Zn²⁺、Mn²⁺等）是金属蛋白酶活性表达的必需条件，直接影响蛋白折叠与功能；
- 有机辅因子（如PLP、NAD）可显著提升目标蛋白的纯化产量与活性，部分蛋白需依赖辅因子实现功能；
- 分子伴侣（如DnaK混合物）能抑制蛋白聚集，促进错误折叠蛋白重折叠，提升蛋白可溶性与活性；
- 氧化还原调节剂（GSSG+PDI）可优化含二硫键蛋白的折叠环境，确保二硫键正确形成，最大化蛋白活性；
- 添加剂组合使用（如金属离子+有机辅因子）可实现蛋白活性的协同提升，满足复杂蛋白的表达需求。
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