无细胞蛋白表达（CFPS）：技术革新与核心应用突破

摘要：本文解析无细胞蛋白表达 CFPS 技术优势，详解其与 AI 协同、膜蛋白及各类难表达蛋白的应用突破，助力蛋白研发提速。

关键词：无细胞蛋白表达、CFPS技术、AI蛋白设计、膜蛋白表达、难表达蛋白、GPCR蛋白、二硫键蛋白、蛋白高通量筛选

无细胞蛋白合成(Cell-Free Protein Synthesis, CFPS)是一种在体外环境中利用细胞来源的核糖体、酶系、tRNAs及能量系统，直接以DNA或mRNA为模板合成蛋白质的技术。与传统细胞表达系统相比，它打破了"必须养活细胞才能生产蛋白"的思维定式，将蛋白合成周期从数周/月级压缩至数小时，实现"设计即生产"。

图1.真核细胞蛋白合成，转录-翻译阶段

一、无细胞技术较传统蛋白表达的核心优势

灵活开放表达系统：可灵活调控pH、氧化还原环境，添加任何所需辅因子、伴侣蛋白、金属离子、去垢剂或纳米盘等。

高通量自动化筛选：反应体积可缩小至纳升级，天然适配微孔板及微流控系统，单日可完成上千个蛋白的合成与筛选。

无细胞毒性限制：可表达对宿主细胞有毒性的蛋白，包括抗生素、细胞毒素和膜蛋白。

直接使用线性模板：无需构建质粒，PCR产物即可作为模板，大幅缩短实验周期。

二、CFPS与AI蛋白质设计的相辅相成

AI正在重塑蛋白质工程的研究范式，但再好的AI模型也需要高质量的实验数据来训练和验证。CFPS作为能与AI设计速度相匹配的技术，正在成为AI驱动蛋白质研发的核心基础设施。

1.解决AI蛋白质设计的三大痛点

验证速度不匹配：传统细胞表达需要4-7天才能验证一个AI设计，而CFPS仅需6小时，使AI迭代速度提升10倍以上。

失败原因不可追溯：CFPS的开放性允许实时监测转录、翻译、折叠和活性等各个环节，准确定位AI设计失败的原因，为模型优化提供关键反馈。

训练数据不足：CFPS可高通量生成序列-功能关系数据，大幅扩充AI模型的训练集，提升预测准确性。

2.应用案例

蛋白酶定向进化：ACS Synthetic Biology研究显示，研究人员利用CFPS在6小时内完成了48个AI生成蛋白酶变体的表达与筛选，最终获得了4倍活性提升的突变体。

抗菌肽优化：Khalil团队利用ChatGPT-4自动生成实验设计代码，结合主动学习策略，将大肠杆菌和HeLa基CFPS系统中colicinM和E1的产量分别提高了2-9倍。

GPT-5自主实验室：2026年2月，Ginkgo Bioworks 与 OpenAI 发布合作研究成果：将 GPT-5 接入 Ginkgo 的云端自动化实验室，构建用于无细胞蛋白质合成（CFPS）优化的闭环自主实验系统。根据双方发布的信息及相关预印本结果，该系统在标准 benchmark 蛋白 sfGFP 的 CFPS 条件优化中，使每克蛋白生产成本较既有 SOTA 基准降低约 40%，同时蛋白生产滴度提升约 27%。需要注意的是，该研究目前为预印本结果，尚未经过同行评审。

3.技术工作流

设计(Design)：使用AlphaFold、RoseTTAFold等工具预测蛋白结构，或利用生成式AI从头设计全新蛋白。

构建(Build)：通过DNA合成或PCR扩增获得线性模板，无需质粒构建。

测试(Test)：在微孔板或者微流控系统中进行CFPS反应，同时完成蛋白表达与功能检测。

学习(Learn)：将实验数据反馈给AI模型，进行下一轮迭代优化。

图2. CFPS与AI蛋白质设计技术工作流

三、膜蛋白表达：CFPS的重要应用

膜蛋白占人类基因组编码蛋白的30%，是超过50%小分子药物的作用靶点(包括GPCR、离子通道和转运蛋白)，但传统细胞表达系统对膜蛋白的表达成功率不足20%。CFPS已成为目前表达膜蛋白有效的技术系统。

1.传统膜蛋白表达的四大障碍

细胞毒性：膜蛋白的过度表达会破坏细胞膜完整性，导致宿主细胞死亡。

折叠困难：膜蛋白需要嵌入磷脂双分子层才能正确折叠，细胞内环境难以控制。

产量低下：即使成功表达，膜蛋白也常以不溶性包涵体形式存在。

提取损失：从细胞膜上抽提膜蛋白时，需要使用去垢剂，容易导致蛋白变性和活性丧失。

图3.GPCR蛋白嵌入脂质双层膜分子模型

2.CFPS膜蛋白表达的两大解决方案

方案一：去垢剂辅助表达

在CFPS反应体系中直接添加温和去垢剂(如DDM、TritonX-100)，使新合成的膜蛋白在表达过程中直接被去垢剂分子包裹，形成可溶性的蛋白–去垢剂复合物。

适用范围：大多数单次跨膜和多次跨膜蛋白

优势：操作简单，成本低廉

注意事项：需筛选去垢剂种类和浓度，避免抑制翻译系统

方案二：纳米盘(Nanodisc)技术

纳米盘是由支架蛋白包裹的磷脂双分子层圆盘，直径约7-17nm，能够模拟天然细胞膜环境。在CFPS反应中加入纳米盘，膜蛋白会自发插入纳米盘中，保持天然构象和活性。

适用范围：GPCR、离子通道等需要膜环境才能发挥功能的蛋白

优势：蛋白处于天然膜环境，活性更高，稳定性更好

3.成功案例

GPCR表达：利用CFPS结合纳米盘技术，已成功表达了超过100种GPCR，包括大麻素受体CB1、多巴胺受体D2等重要药物靶点。

离子通道：成功表达了电压门控钾通道、钠通道和钙通道，并用于药物筛选和电生理研究。

转运蛋白：表达了ABC转运蛋白、葡萄糖转运蛋白等，为研究耐药机制和代谢疾病提供了重要工具。

图4.nuclera GPCR专用纳米盘，由膜支架蛋白与磷脂分子自组装形成的可溶性纳米级磷脂双层盘状结构，能为GPCR等膜蛋白提供接近天然的类膜环境，保持其天然构象与生物学活性。

四、难表达蛋白：CFPS的"疑难杂症专线"

除了膜蛋白，还有许多蛋白在传统细胞系统中难以表达，包括毒性蛋白、超大/超小蛋白、富含二硫键的蛋白、重复序列蛋白等。CFPS凭借其独特的优势，为这些"老大难"蛋白提供了有效的解决方案。

1.毒性蛋白表达

毒性蛋白会抑制宿主细胞的生长和代谢，甚至导致细胞死亡，因此在传统细胞系统中几乎无法表达。CFPS由于没有活细胞，完全不受蛋白毒性的影响，是表达毒性蛋白的理想选择。

典型应用：

· 抗生素：如青霉素结合蛋白、万古霉素抗性蛋白

· 细胞毒素：如白喉毒素、蓖麻毒素、肉毒杆菌毒素

· 限制性内切酶：如BsaI、EcoRI等，这些酶会切割宿主细胞的DNA，在细胞内表达会导致细胞死亡

· 病毒蛋白：许多病毒蛋白对宿主细胞有毒性，CFPS可安全快速地表达这些蛋白，用于疫苗研发和抗病毒药物筛选

2.富含二硫键的蛋白

二硫键的形成需要氧化环境，而大肠杆菌等原核细胞的细胞质是还原环境，不利于二硫键的形成。CFPS可以通过调整反应体系的氧化还原环境，轻松实现富含二硫键蛋白的正确折叠。

优化策略：

· 添加二硫键异构酶(PDI、DsbA、DsbC)促进二硫键的正确形成

· 加入谷胱甘肽氧化还原对(GSSG/GSH)，准确控制氧化还原电位

· 使用氧化型的细胞提取物，如经过氧化处理的大肠杆菌提取物

成功案例：已成功表达了含有17个二硫键的组织纤溶酶原激活剂(tPA)和含有12个二硫键的单克隆抗体，活性与天然蛋白相当。

3.超大/超小蛋白

超大蛋白(>100 kDa)：传统细胞系统中，超大蛋白的表达效率低，且容易发生降解。CFPS可以通过优化翻译延伸因子和能量系统，表达分子量高达250 kDa的蛋白，如聚酮合酶(T1PKS)。

超小蛋白(<10 kDa)：小肽在细胞内容易被蛋白酶降解，CFPS可以通过添加蛋白酶抑制剂和优化反应条件，稳定表达小肽和多肽药物。

4.重复序列蛋白

重复序列蛋白(如胶原蛋白、弹性蛋白、蜘蛛丝蛋白)在细胞内表达时，容易发生基因重组和缺失，导致表达失败。CFPS直接以DNA为模板进行体外转录和翻译，避免了基因不稳定的问题，可稳定表达各种重复序列蛋白。

以上我们了解了CFPS技术的核心原理、与AI的协同模式，以及它在膜蛋白和各类难表达蛋白领域的突破性应用。而这项技术的价值远不止于此，它在酶工程领域的革新更是为生物催化剂开发按下了加速键，同时也正在重塑整个生物制造产业的未来格局。

本文由中国抗体蛋白方案提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享。上海曼博生物可提供eProtein Discovery无细胞蛋白表达筛选系统、Cell-Free System蛋白表达系统及难表达蛋白快速制备解决方案产品与技术支持（https://www.mine-bio.com/nuclera/）。

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Nuclera无细胞蛋白表达筛选系统技术专栏：https://www.mine-bio.com/Nuclera-article/