PBS Mini中iPSC聚集体3D培养系列1：从2D到3D的无缝衔接｜曼博生物

发布时间：2026/05/27 点击数：5

摘要：本文针对iPSC 3D悬浮培养的常见痛点，详解PBS Mini中2D种子培养的标准化方案、关键参数与进阶技巧，助力实现从2D到3D的平稳过渡，为细胞治疗规模化生产提供可靠支撑。

关键词：ipsc,诱导多能干细胞,iPSC培养,3D聚集体培养,垂直轮生物反应器,2D种子培养, iPSC聚集体培养,PBS Mini生物反应器,细胞治疗规模化,灌流生物反应器

PBS Mini中iPSC聚集体培养标准化攻略

在细胞治疗从实验室走向临床的进程中，多能干细胞（PSC）的规模化、标准化培养始终是核心瓶颈。许多具备成熟2D PSC培养经验的研究者，在转向3D悬浮放大时，常常遭遇细胞扩增效率低、批次间差异大、干性丢失、细胞库资源消耗过快等难题。

作为PBS垂直轮生物反应器的核心技术合作伙伴，曼博生物始终致力于为中国区生物制药研究者提供从工艺开发到规模化生产的技术支持方案。基于PBS Biotech近期发布的标准化工艺数据，我们为大家拆解PSC聚集体培养中较关键的2D种子培养环节，助力您实现从2D到3D的平稳过渡，打造稳健、可重复的细胞治疗生产工艺。

一、为什么2D种子培养是3D培养及放大的“基石”？

接种到生物反应器中的细胞质量决定了第三代培养的成功与否。在进行3D培养之前，必须在2D培养中扩增细胞，我们称之为2D培养（2D Seed Train）。这一过程有几个目的：

✅首先是生产足够数量的细胞，以便接种到大规模的培养体系如生物反应器中；

✅其次，通过减少所需细胞数量来保护母细胞库资源；

✅此外，还能帮助细胞在较低压力的环境中恢复先前的保存状态，从而减少3D培养中的滞育时间；

✅最后，避免在3D培养中多次传代，这可能导致基因不稳定性。

2D种子训练流程

图1.2D种子训练流程

二、PBS Biotech标准化2D种子培养方案及参数

以下是PBS Biolab实验室推荐的2D培养参数，如接种密度、培养时间、换液策略、酶解时间以及离心设置，这些参数已在各种2D培养容器中验证，包括培养板、培养瓶等。该协议已经在多种诱导型干细胞系、干细胞培养基、细胞外基质涂层基质和相关科学中进行过测试，且一贯地能够产生高质量的PSC，准备接种到3D培养中。

推荐的2D种子训练培养参数

图2.推荐的2D种子训练培养参数

关键试剂使用规范

ROCK抑制剂（Y-26732）是单细胞接种的核心保障，推荐在以下三个环节使用10 µM工作浓度：

1. 单细胞悬液的稀释与重悬

2. 培养容器中预分装的培养基

3. 细胞解离酶溶液

三、材料选择：经过验证的兼容试剂清单

试剂的质量和兼容性直接影响工艺稳定性。对于不同研发需求，不一定要使用这些确切的材料。较佳的材料选择应是那些与研究所用的细胞系兼容且满足成本、供应、可用性、质量认证以及是否化学定义等要求的材料。

PBS Biolab团队已经筛选了多种PSC培养试剂的组合，结果表明，它们与其推荐的2D培养到3D聚集体培养协议没有任何不兼容的情况。如果老师们在使用选定的试剂时没有成功，建议尝试其他试剂。在开始工艺开发研究时，尽可能进行多种物料筛选，并查看哪些对您的细胞系较有效。如下图所示，PBS反应器Biolab团队尝试过的每种市售培养基都能够支持iPSC在3D培养中的聚集和扩增。因此在开始时，建议老师们尝试几种不同的选择，以便根据下游目标和限制，找到较适合您细胞系的培养基。

经证实与PBS反应器Biolab团队推荐的2D和3D培养方案兼容的材料

图3.经证实与PBS反应器Biolab团队推荐的2D和3D培养方案兼容的材料

根据您的应用，您的2D培养方案可能不完全遵循我们的建议，但在转向3D培养之前，建议对2D培养进行充分表征，以便了解细胞预期的生长、形态和pH变化，并确保其可重复性（即在完全相同的操作条件下得到相同的结果）以及其稳健性（即在改变一些非关键变量，如操作员、物料批次或同一细胞系的微小差异时，仍能得到类似结果）。确保2D培养系统充分理解并得到良好控制，是推进到3D培养之前的关键步骤，这样才能公平评估和比较3D培养中的实验结果。

四、工艺稳健性：可重复的产量与细胞质量

如果遵循推荐的2D培养协议，虽不同的细胞系会表现不同，但下图中这些数据代表了30次独立操作的平均值，标准差表示误差范围，可以参考下。在使用推荐的protocol时，细胞从冷冻保存恢复的初期，初次传代时，细胞的倍增时间较长，而在2D培养中进行的累积倍增数则十分稳定，显示出protocol的可重复性。总的来说，一套合格的种子培养工艺，必须在不同操作人员、不同细胞系间保持稳定。