注：本研究由杜伦大学、欧洲瑞博赛尔（REPROCELL）与Qkine合作研究发布

引言

皮肤是一种复杂的多层器官，构成一道完整屏障，抵御物理、化学及病原体侵袭。从结构上看，皮肤主要分为两大组织区域：表皮，主要由角质形成细胞构成的复层上皮组织；真皮，富含细胞外基质与成纤维细胞的支撑性结构结缔组织层[1]。

人工构建的人体皮肤等效模型是科研、临床及工业领域的重要工具。它可作为传统体外二维细胞培养与体内动物模型的有效替代方案，后两者通常难以准确模拟人体解剖结构与生理功能。依据英国国家实验动物替代、优化与减少研究中心（NC3Rs）及欧盟（化妆品法规 EC 1223/2009）等机构的原则与指导要求，临床前化合物评价正逐步摆脱对动物模型的依赖 [2,3]。因此，构建具有生理相关性的模型对推动皮肤病学研究发展很重要。然而，由于人体皮肤在细胞组成与结构上高度复杂，想要建立稳定、可重复且能准确模拟天然组织生物学特性的体外模型具有挑战性。

REPROCELL公司的Alvetex支架为构建人工皮肤模型提供了优质工具，无需使用外源性合成或动物源细胞外基质成分。Alvetex是一种高孔隙率、惰性聚苯乙烯膜，其结构可支持细胞自然浸润与增殖，并实现三维（3D）营养物质扩散。这一独特结构使真皮成纤维细胞能够以三维方式生长，从头合成并沉积细胞外基质，形成在结构与生化特性上均接近天然人体皮肤的真皮等效体（DE）。

REPROCELL公司利用该技术开发了REPROSKIN产品：一种商业化、稳定且可重复的全层皮肤模型。将人原代角质形成细胞接种于真皮等效体的上表面，可在真皮 - 表皮连接处形成富含 Ⅳ 型胶原的基底膜。角质形成细胞随后增殖、分化、复层化并角质化，形成具有完整结构的多层表皮组织，包含基底层、棘层、颗粒层与角质层，重现天然人体皮肤的体内结构 [4]。为维持细胞活性、促进细胞生长、分化与成熟，REPROSKIN采用专用培养基培养，并添加重组细胞因子与生长因子。

Qkine是一家专注于重组蛋白生产的企业，其产品为完全无动物源、高生物活性的生长因子与细胞因子，其中包括目前市面上特有的无动物源重组转化生长因子-β1（TGF-β1）。Qkine生长因子具备批间生物活性一致性、高纯度与无菌性保障，是复杂三维组织培养的理想选择。曼博生物是Qkine在中国地区的官方代理，如果需要欢迎您点击咨询。

本文将介绍欧洲REPROCELL公司与Qkine公司合作开展的一项研究，旨在评估Alvetex支架技术与高纯度重组生长因子联合应用，对优化皮肤模型构建及提升其可重复性的效果。

材料与方法

1. 全层人体皮肤等效模型的构建

置于6孔板中的12孔式Alvetex支架插入式小室，依次经70%乙醇、无菌PBS及培养基（每孔10ml）清洗后，用于细胞接种。

将12孔式Alvetex支架插入式小室置于6孔板中，依次经70%乙醇、无菌PBS及培养基（每孔10ml）清洗后，用于细胞接种。

将原代人真皮成纤维细胞（HDFn；第4～7代）以每孔 0.5×10⁶个的密度，接种于支架膜上，接种体积为100μl 维持培养基1；在37℃、5% CO₂的饱和湿度培养箱中孵育2小时，以促进细胞黏附于支架。随后将小室浸入培养基1（每孔10ml），继续培养18天；每3～4天更换一次培养基。真皮等效体培养体系中添加Qkine TGF‑β1 PLUS（转化生长因子β1；Qk010），以促进细胞从头合成并沉积细胞外基质。

在真皮成纤维细胞培养的第19天，吸去各孔培养基1。将原代人表皮角质形成细胞（HEKn；第4代）以每孔 1.3×10⁶个的密度，接种于支架小室的上表面，接种体积为200μl维持培养基 2；在37℃、5% CO₂的饱和湿度培养箱中孵育2小时，促进细胞黏附于真皮等效体。随后将模型浸入培养基2（每孔10ml），继续培养48小时。

为促进角质形成细胞分化与分层，在角质形成细胞接种第3天，将模型提升至气‑液界面（ALI）进行培养。彻底吸去小室基底侧与顶端的培养基2，将每个小室转移至 Alvetex 支架托架与深层培养皿（AVP015‑2；AVP015‑10）中，采用中位悬挂方式培养，每皿可放置3个模型。向模型小室的基底侧加入培养基3（每皿30ml）。随后继续培养14天，再用于后续实验；每3～4天更换一次培养基。培养结束后收集样本，用于下游分析。全层人体皮肤等效模型培养体系中添加Qkine KGF（角质形成细胞生长因子；Qk046），以维持角质形成细胞活性并促进其分化。

2. 培养基配方

a. 维持培养基1（完全成纤维细胞培养基）：

DMEM 培养基，添加 10%（v/v）胎牛血清、100 U/ml 青霉素 / 链霉素及 2 mM L‑谷氨酰胺。

b. 维持培养基2（完全角质形成细胞培养基）：

GibcoEpilife培养基（含 60 mM CaCl₂），添加 1%（v/v）Gibco人角质形成细胞生长添加物（HKGS）及 100 U/ml 青霉素 / 链霉素。

c. 培养基1（真皮等效体培养基，DE medium）：

完全成纤维细胞培养基，添加 100 μg/ml 抗坏血酸及 5 ng/ml TGF‑β1 PLUS（Qkine；Qk010）。

d. 培养基2（全层皮肤培养基，FTS medium）：

完全角质形成细胞培养基，添加 100 μg/ml 抗坏血酸、140 mM CaCl₂及 10 ng/ml KGF（Qkine；Qk046）。

e. 培养基3（气液界面培养基，FTA medium）：

完全角质形成细胞培养基，添加 100 μg/ml 抗坏血酸、1.64 mM CaCl₂及 10 ng/ml KGF（Qkine；Qk046）。

结果

1. TGF‑β1 PLUS可促进真皮等效体形成

首先将原代人真皮成纤维细胞与 Alvetex 支架膜共培养 19 天，完成真皮等效体的构建。实验全程添加Qkine 重组 TGF‑β1 PLUS（Qk010），以支持成纤维细胞增殖及从头合成细胞外基质（ECM）。H&E染色的组织学分析显示：成纤维细胞充分浸润支架膜并呈均匀分布（图 1A）。在整个培养周期内，成纤维细胞均保持良好活性，并呈现细长梭形的典型形态。

随后将原代人表皮角质形成细胞接种于真皮等效体的上表面，继续培养 16 天。H&E 染色结果证实：该真皮等效体可提供充足的力学与生化支撑，维持上层表皮组织层的形成，最终构建出全层人体皮肤等效模型（图 1B）。针对真皮基质标志物Ⅰ 型胶原（collagen‑I）与纤连蛋白（fibronectin）的免疫荧光染色结果表明：经 Qkine 重组 TGF‑β1 PLUS（Qk010）处理的真皮成纤维细胞，可在支架膜内内源性从头合成并沉积细胞外基质成分（图 1C、图 1D）。

图1. 添加 TGF‑β1 PLUS可促进细胞外基质沉积，并助力全层皮肤等效模型中真皮‑表皮结构分区的形成。

（A）成纤维细胞培养前 19 天全程添加 Qkine TGF‑β1 PLUS后，真皮等效体的代表性苏木精‑伊红（H&E）显微图像；

（B）全层皮肤等效模型的代表性 H&E 显微图像；

（C、D）全层皮肤等效模型真皮层内 Ⅰ 型胶原（C，绿色）与纤连蛋白（D，绿色）的代表性免疫荧光显微图像，显示大量细胞外基质沉积。细胞核用 Hoechst 33342 复染（蓝色）。比例尺 = 50 μm。

为评估 Qkine TGF‑β1 PLUS（Qk010）相较于其他供应商产品的生物活性，我们对真皮等效体结构内的总胶原沉积量进行了定量检测。在相同添加浓度的培养基条件下，TGF‑β1 PLUS可明显上调人真皮成纤维细胞的胶原合成水平，并增强支架结构内的细胞外基质（ECM）沉积（图 2）。综上结果表明：Qkine TGF‑β1 PLUS可用于提升三维组织模型的构建效率与质量。

图2. 与竞品相比，使用 TGF‑β1 PLUS培养的真皮等效体（DE）总胶原沉积量更高。

在成纤维细胞培养第 19 天收集真皮等效体，通过羟脯氨酸定量法（Quickzyme, Leiden, Netherlands）测定总胶原含量。在相同浓度条件下，与使用其他品牌 TGF‑β1 培养的模型相比，添加 Qkine TGF‑β1 PLUS的模型具有更高的胶原含量。

2. 添加KGF可支持表皮分化与成熟

将角质形成细胞接种至真皮层后，模型在添加KGF（FGF‑7；Qk046）的生长培养基中继续培养。H&E染色结果显示，模型成功形成多层表皮结构，在真皮等效体上方清晰呈现出基底层、分化层及角质化层的角质形成细胞分层（图 3A）。角蛋白 14（Keratin‑14）特异性定位于基底角质形成细胞，而角蛋白 10（Keratin‑10）在基底上层细胞中高表达，进一步证实形成了结构规整、分化成熟的表皮组织层（图 3B）。

图3. 添加 KGF 可促进角质形成细胞分层与分化。

（A）经 Qkine KGF 培养的全层皮肤等效模型表皮层代表性苏木精‑伊红（H&E）显微图像。

（B）角蛋白 10（K10，绿色）与角蛋白 14（K14，红色）代表性免疫荧光显微图像，显示中间丝蛋白的特异性定位。细胞核用 Hoechst 33342 复染（蓝色）。比例尺 = 50 μm。

在添加 KGF（FGF‑7；Qk046）培养后，通过检测全层皮肤模型表层的经表皮水分流失（TEWL），客观评估其完整屏障功能。TEWL数值与天然人体皮肤的已发表数据一致，表明该模型系统具有良好的生理相关性（图 4）[5]。

图4. 采用Qkine添加因子与生长因子构建的全层皮肤等效模型可形成完整的表皮屏障。

使用 VapoMeter 探头（Delfin Technologies, Kuopio, Finland）在表皮层顶端表面测定经表皮水分流失量（TEWL）。测得数值与天然人体皮肤相近。

结论

在REPROSKIN模型构建全程中，使用Qkine高纯度、准确定性的生长因子进行添加，可有效支持细胞分化与组织结构形成。TGF‑β1 PLUS可促进真皮层构建，而 KGF（FGF‑7） 则有助于角质形成细胞增殖与分层。

综上，本合作研究建立了一套有价值的体外研究系统，可用于皮肤相关的学术研究、工业研发及商业化应用。

关于Qkine品牌

QKine总部位于英国剑桥，是一家通过ISO9001:2015认证的公司。作为蛋白质创新的指引者，产品范围涵盖了多个应用领域，旨在提高您研究的可重复性。QKine积极支持并创新于新兴领域，如类器官和器官芯片、细胞农业、再生医学、合成水凝胶和生物打印等。

凭借强大的制造流程，QKine生产高纯度、高品质、无动物成分的生长因子、细胞因子和其他复杂蛋白质，其中约30%的产品目录由独特的产品组成，包括无标签的热稳定FGF-2 (FGF2-G3)，首个无动物、化学成分限定的TGF-β1，用于的干细胞培养基，以及无动物成分的HGF (NK1)。

QKine可以通过提供批量预订、批量订单、定制装瓶和质量保证（QA ）来支持规模化和商业制造。

Qkine细胞因子推荐阅读

• Qkine｜iPSC向三胚层分化系列-中胚层
• Qkine iPSC：神经系列分化试剂盒

文献参考

您可进入曼博生物官网QKine产品页，详细了解QKine细胞因子每款产品。若您对QKine细胞因子感兴趣，欢迎咨询上海曼博生物。