3D培养应用之全长LN521组合221提高PSCs来源心肌细胞分化效率

一、引言

近日，心脏类器官在国内的生物医药研究领域可谓是小火了一把，直径超过1厘米、自发分化、一体成型的iPSCs来源的心脏类器官已被我国科学家成功培养出来，这一进展有望使类器官在临床应用治疗场景出现更多可能性。那么，不得不提有关于iPSCs分化为心肌细胞在未来临床治疗、药物开发中具有重要的发展潜力，比如其可以直接作为细胞疗法制剂使用、作为组织特异性细胞外囊泡的来源材料，以及作为药物开发的模型以进行药筛。这些应用都需要标准化、可重复且有效的PSCs衍生心肌细胞支持。

本文将详细介绍由Yap L等人（2019及2023年）已发表的采用全长层粘连蛋白LN521组合221，生成无异源成分且具有明确来源的心血管祖细胞（CVPs）与心肌细胞（CMs）的策略。相较于其他标准化基质底物，该方法心肌细胞分化的效率较高。这些细胞在移植至猪心脏梗死区域后，随时间推移逐渐成熟并展现出重要的心肌细胞功能性特征，如收缩能力与电生理特征，进而逐步恢复部分心脏功能。

二、亮点

•  LN521和LN221支持多能干细胞PSCs在2D及3D培养中有效分化为心肌细胞

•  有助于心肌细胞成熟，呈现典型的收缩功能（第九天）与电生理特征

•  形成标准化的培养体系，减少细胞分化过程中的差异

•  无动物来源成分且化学成分明确，适用于从研究到临床的多个场景

三、数据展示

1、LN521与LN221组合可设计稳定的标准化实验流程

在分化流程方面，LN521联合LN221可在第 9 天形成心血管祖细胞（CVPs），第 11 天分化为定向心脏祖细胞（CCPs），到第 34 天可获得功能成熟的心肌细胞（数据图1）。这种稳定的时间进程为研究心肌细胞发育阶段提供了可参考的时间节点，有助于标准化实验流程。

数据图1. LN521+221联合生成PSCs-CMs流程。免疫组织化学：α-actin（绿色），细胞核DAPI染色（蓝色）。比例尺100µM

2、LN521与LN221组合能有效的提高心肌细胞的生成比例

在分化效率方面，传统的心肌细胞分化常面临效率不稳定的问题，而采用 LN521 与 LN221 组合作为底物时，多能干细胞分化为心肌细胞的比例可达到 85%（流式细胞术检测结果），明显高于单独使用 LN521 或玻连蛋白（VN/VTN）的情况（数据图 1A、B）。这一结果表明，两种层粘连蛋白的组合能为细胞分化提供更适宜的微环境，推动多能干细胞向心肌细胞方向分化。

数据图2. 流式细胞术检测不同底物策略下CMs的分化标志物阳性率及CMs分化比例量化图

3、心肌分化关键基因的动态变化符合心肌细胞发育规律

在基因表达方面，对94天分化流程的细胞进行基因表达水平分析发现，在第 9 天和第 11 天，心血管祖细胞（CVPs）和定向心脏祖细胞（CCPs）的标志性基因呈现特征性表达模式，且在两种不同细胞系（HS1001、FUT4）中表现出一致的变化趋势（数据图3）。这种基因表达的规律性为理解心肌细胞分化的分子机制提供了参考，也说明该方法具有较好的可重复性。

数据图3. 两种不同的细胞系中PSCs-CMs 94天分化各阶段特征性基因表达图谱

4、LN521与LN221组合能帮助心肌细胞呈现典型的生理及功能性特征

在细胞成熟方面，通过免疫细胞化学检测发现，第 34 天的心肌细胞表达心脏特异性标志物，如肌钙蛋白 I（TNNI3，红色）、同源盒蛋白 Nkx-2.5（NKX2-5，绿色）和肌钙蛋白 T（TNNT2，绿色），其中 TNNT2 在细胞质中呈现清晰的肌节条纹，与天然心肌细胞的结构特征一致（数据图4）。这些标志物的表达证实了细胞的心肌属性及结构成熟度。

数据图4. 分化第34天时CMs的特征性标志物免疫组织化学染色代表性图像。比例尺100µM

此外，功能检测显示，采用LN521和LN221组合底物培养的心肌细胞在第 9.5 天左右，相较于多种底物更早出现收缩活动（数据图5A）。同时，通过电生理检测可记录到心室样、窦房结样和心房样心肌细胞的动作电位（数据图5B），表明这些细胞具备了不同类型心肌细胞的典型性电生理功能，为模拟心脏电活动提供了可靠的细胞模型。

数据图5. 分化第9.5天时不同底物策略中PSCs-CMs收缩功能检测及电生理动作电位检测的代表性图像

5、LN521和LN221组合分化的心肌细胞能在受损心脏中存活并发挥作用

将第 11 天的定向分化心脏祖细胞（CCPs）移植到心肌梗死的猪心脏内后，通过免疫染色可观察到，移植后 4 周和 12 周，移植细胞仍能表达心肌特异性基因 ACTN2（红色），并保持人类细胞的特征性基因huKu80（绿色），表明细胞成功整合到宿主心脏组织中（数据图 6）。长期观察发现，这些整合的细胞能逐渐恢复部分心脏功能，为细胞治疗的可行性提供了临床前证据。

数据图6. 移植分化第 11 天的PSCs-CCPs至心肌梗死心脏及4周和12周的CMs特异性标志物的免疫组织化学染色代表性图像。比例尺100µM

并且，LN521 还可用于水凝胶功能化及 3D 生物打印。在 3D 模型构建中，CMs的肌节长度随培养时间逐渐增加，第 5 天时约为 0.95μm，到第 30 天可达到 1.99μm（数据图 7，p＜0.05具有统计学意义），进一步证实了该基底有助于CMs在三维环境中成熟，为构建心肌组织模型提供了相关数据支持。

数据图7. LN521功能化水凝胶3D培养心肌测量肌节长度及健康供体来源的肌节长度增长趋势统计图。肌节长度测量（红色标尺）比例尺=5µm

四、总结

综上所述，LN521与LN221组合底物在PSCs-CMs分化相关研究中展现出较大优势，其不仅能有利于其分化效率、助力细胞成熟，还能支持细胞在体内外发挥功能，为心脏发育研究、疾病模型构建、药物筛选及细胞治疗等领域提供了实用的工具。期待这种方法在生物医学研究及临床转化中发挥出更多价值。

参考资料

Cardiomyocyte differentiation on a combination of full-length Biolaminin 521 and Biolaminin 221 substrates（From BioLamina）

（了解更多详细信息及获取原文件，请联系上海曼博生物！）

让我们共同关注细胞治疗领域的发展，期待更多突破！