CNBio器官芯片｜3D灌流黑色素瘤模型评估CAR-T细胞疗法

本文为2026年6月22日至24日，CNBio在葡萄牙布拉加的EUROoCS Annual Meeting（欧洲器官芯片年会）上展示的海报，该项目由欧盟资助，同时英国和瑞士合作单位分别由本国科研资助机构提供经费支持。需要原文的可联系曼博生物获取。

一、用于评估CAR-T细胞疗法疗效与毒性的3D灌流黑色素瘤芯片模型

癌症芯片（Cancer-on-a-chip）等临床前模型正处于癌症研究的前沿；然而，能够完整模拟CAR-T细胞等免疫治疗全过程免疫级联反应的模型仍然十分有限。这些过程包括：血液循环、跨内皮迁移、肿瘤浸润以及癌细胞裂解。利用更相关的体外系统重建肿瘤微环境所形成的物理和生化屏障，对于研究CAR-T细胞针对原发肿瘤的作用表现很重要，同时还能为其潜在不良反应提供深入认识。

作为Melomanes项目（利用磁性纳米颗粒治疗转移性黑色素瘤的联合疗法）的一部分——这是一个覆盖整个欧盟的研究联盟，致力于开发一种结合抗HLA-GCAR-T细胞和能够诱导局部高温的磁性纳米颗粒的免疫治疗策略——本项目旨在开发一种更相关的黑色素瘤芯片模型，用于评估CAR-T细胞治疗的疗效与安全性。

该模型基于 PhysioMimix Core（CNBio Innovations）构建，通过培养基循环模拟血液流动。基于Transwell的双腔室策略能够实现趋化因子调控的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）单层上的免疫细胞迁移。这类基于人体来源细胞的临床前模型有望提高预测准确性，同时减少对体内动物实验的依赖。

二、研究目标是什么？

• 利用人黑色素瘤细胞系SK-MEL-5构建黑色素瘤芯片模型。
• 构建由HUVEC组成的人源内皮屏障，并研究TNF-α刺激引起的内皮活化。
• 评估基底侧灌流（basolateral perfusion）对内皮屏障形成的影响。
• 评价趋化因子介导的CAR-T细胞运动能力及其跨越内皮层迁移能力，并分析其与内皮活化状态之间的关系。

• 研究不同灌流条件及内皮活化状态下CAR-T细胞的细胞毒性作用。

三、研究方法

1.黑色素瘤芯片模型的建立

• 利用PhysioMimix系统建立效应细胞/内皮细胞器官芯片系统。
• 将HUVEC接种于IV型胶原（Collagentype IV）包被的Transwell上，并在0.5μL/s的培养基灌流速率下培养48h。
• 通过免疫荧光染色（F-actin、ZO-1）、跨内皮电阻（TEER）以及采用4kDaFITC-dextran的细胞旁通透性检测，对屏障形成情况进行评价。
• 采用慢病毒（lentivirus）转导使SK-MEL-5稳定表达HLA-G，以确保其细胞表面持续表达。

2.模型生成的时间进程如下图

四、结果

1.经TNF-α处理后，可诱导VCAM-1表达上调，并导致细胞黏附丧失、细胞形态发生改变以及内皮层通透性增加（图3）。

a：左图为相差显微图像，右图为相差显微图像与Phalloidin-FITC荧光图像的叠加图，显示Transwell膜孔已被HUVEC覆盖。

b：TNF-α处理后，Transwell上内皮细胞间黏附丧失（Phalloidin，绿色，1:400；ZO-1，红色，1:1000）。

c：TNF-α刺激后，免疫荧光（IF）染色显示VCAM-1表达上调（左图，1:500）；同时，细胞形态表现为细胞体分离并呈细长状（右图，96孔板）。

2.通透性检测和TEER检测结果表明，在灌流培养48h后，内皮屏障完整性达到高水平（图4）。

a.人Ⅳ型胶原包被Transwell膜可提高内皮屏障完整性。

b.基底侧灌流和细胞接种方向均会影响内皮屏障完整性。

c.HUVEC内皮屏障完整性具有时间依赖性，随接种后的培养时间而发生动态变化。

3.CAR-T细胞能够跨越Transwell膜发生迁移，其迁移能力受内皮活化状态、趋化因子浓度以及培养基灌流条件的影响（图5）。

a.灌流和HUVEC的培养均会影响免疫细胞的迁移率及其滞留程度。

b.细胞因子刺激、灌流以及缺乏趋化因子信号均导致免疫细胞的基础回收率更低。

4.CAR-T细胞诱导的肿瘤细胞死亡效应细胞与靶细胞比例（Effector-to-Targetratio，E:T）及培养基灌流条件调控。CAR-T细胞在完成跨内皮迁移后仍保持细胞毒性，但其杀伤效率低于直接接触靶细胞时的水平（图6）。

a.癌细胞死亡速率取决于效应细胞与靶细胞比例（E:T）。

b.在24h时，灌流培养可使较低E:T比例下仍产生细胞毒作用。

c.跨越血管内皮屏障的迁移会影响癌细胞死亡速率，其作用取决于细胞因子处理。

五、结论

1. 本研究构建了一款黑色素瘤芯片模型，体系共包含原代抗人类白细胞抗原G（HLA-G）CAR-T细胞、内皮细胞系与肿瘤细胞系，可在动态流体体系中复现CAR-T细胞免疫级联反应的核心过程。
2. 血管通透性实验证实，优化胞外基质（ECM）包被方案并配合灌流培养，能够明显提升人脐静脉内皮细胞（HUVEC）屏障结构的完整性。
3. 基于荧光素酶的细胞毒性检测结果显示，CAR-T细胞可介导明显的肿瘤细胞裂解效应；该杀伤效果取决于效靶比（E:T）、基底侧灌流条件以及靶细胞抗原表达水平。
4. 分别经肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理、未处理的人脐静脉内皮细胞接种于Transwell小室后，会形成屏障阻隔层；相较于无屏障共培养体系，该结构会大幅降低SK-MEL-5黑色素瘤靶细胞的裂解效率。

5. 该器官芯片系统可作为贴合生理真实环境的临床前研究工具，用于实体瘤中CAR-T细胞的迁移浸润与药效评估，有望应用于细胞治疗方案优化及安全性评价工作。

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