InSphero Akura PLUS悬滴系统是一种简单、灵活且能兼容自动化系统的操作平台，用于无支架3D细胞培养、观察和观测。每套InSphero Akura PLUS悬滴系统是由一块InSphero Akura PLUS悬滴板和一块InSphero Akura 96孔细胞微孔板组成。平日里，InSphero将该悬滴系统用于大规模的无支架3D细胞培养、类器官培养和即用型细胞微组织的生产。
1. 使用InSphero Akura PLUS悬滴板可以形成稳健的包含细胞微球体的悬滴，轻松开展无支架3D细胞培养、类器官培养等工作
2. 包含细胞微球体的悬滴可以方便地转移到InSphero Akura 96孔细胞微孔板中继续培养
3. 细胞微球体在具有特殊设计的InSphero Akura 96孔细胞微孔板中，可以方便地进行长时间的培养、分析和观察
1. 实验细胞与合适的培养基
2. 倒置显微镜
3. 细胞计数工具
4. 移液器/自动化液体处理系统
5. 板孔离心机
6. 二氧化碳培养箱（设置为5%浓度二氧化碳，95%相对湿度，37摄氏度）
7. PBS
1. 培养基于37摄氏度预热
2. 用70%乙醇擦拭微孔板的外包装
3. 在无菌操作环境下小心地打开微孔板的外包装
4. 检查InSphero Akura PLUS悬滴系统里的组分是否完整：
(1) InSphero Akura PLUS悬滴板：带有蓄液功能的底板，悬滴板框架，板盖，加湿垫和镊子
(2) InSphero Akura 96孔细胞微孔板：微孔板，板盖
1. 准备一个具有蓄液功能的无菌容器（如10cm细胞培养皿），向其中加入20mL的0.5X PBS
2. 取出加湿垫，用镊子夹取加湿垫转入装有PBS的容器中浸泡直至加湿垫完全湿润（此过程约需要5min）
3. 将悬滴板框架从底板中暂时移出，用镊子夹取加湿垫并放置在底板中，放回悬滴板框架
1. 依据实验设计，将要接种的细胞或细胞混合物制备成单细胞悬液
2. 使用血球计数板或其他合适的细胞计数工具进行细胞计数，并确定合适的细胞接种密度
3. 使用移液器充分吹洗细胞悬液，确保悬液中的细胞均匀分布，并取合适数量的细胞，用培养基将体积补足40uL
* 推荐的细胞接种密度：用于增殖细胞的长期培养，建议使用较低的起始密度，建议每孔接种250-500细胞；用于非增殖细胞的培养或需要快速获得较大体积的细胞微球体，建议每孔接种2500-25000细胞
4. 缓慢地将40uL的细胞液接入悬滴板上对应的培养孔中，在加入液体时要确保吸头尖端与板子间的紧密接触
5. 板盖盖好后转移入二氧化碳培养箱中培养，并定期评估细胞微球体的生长状况。正常情况下，大部分类型的细胞经过4天的培养便可以聚集形成紧密的细胞微球体
* 需注意：在移动InSphero Akura PLUS悬滴板时需要格外当心，以防止悬滴液的滴落而影响实验结果
* 如需要长期培养细胞微球体，则要将细胞微球体转移入InSphero Akura 96孔细胞微孔板中
InSphero Akura 96孔细胞微孔板的介绍和使用方法请参考相应的使用说明。在开始操作本步骤之前，应该按照要求提前预湿润InSphero Akura 96孔细胞微孔板
1. 将InSphero Akura PLUS悬滴板的悬滴框架小心取下，置于InSphero Akura 96孔细胞微孔板的上方。两者可以通过板框周边的三个针脚确定位置
2. 使用移液器缓慢地向InSphero Akura PLUS悬滴框架的每个孔中加入70uL的培养基，在加入液体时要确保吸头尖端与板子间的紧密接触。加入液体后，悬滴便会落入下方的InSphero Akura 96孔细胞微孔板相应培养孔中
3. 使用倒置显微镜检查每个培养孔中的细胞微球体是否成功转移
4. 将InSphero Akura 96孔细胞微孔板盖好盖子并放入板孔离心机中，250 x g（RCF）离心2min，以帮助去除培养孔内的残留气泡并帮助细胞沉降至培养孔的底部
5. 为了确保每个培养孔中的培养基体积准确，应执行换液操作，吸去培养孔内的所有培养基，然后重新加入70uL的新鲜培养基（遵照InSphero Akura 96孔细胞微孔板的使用说明执行更换培养基的操作）
| 项目 | Akura PLUS Hanging Drop System |
|---|---|
| 培养模式 | Hanging Drop 悬滴培养 |
| 板规格 | 96 孔 |
| 推荐悬滴体积 | 40 μL/drop |
| 长期培养推荐细胞数 | 250–500 cells/drop |
| 大型/快速形成球状体 | ≥2,500 cells/drop |
| 球状体尺寸一致性 | 直径变化 ≤5% |
| 球状体转移 | 转移至 Akura 96 Plate |
| 转移时加入体积 | 70 μL |
| Akura 96 培养体积 | 50–70 μL/well |
| 推荐培养箱湿度 | >95% RH |
| 典型观察方式 | 倒置明场显微镜 |
| 推荐物镜 | 10× 长工作距离物镜 |
Akura PLUS Hanging Drop System 是一种用于3D 球状体（Spheroid）和微组织（Microtissue）培养的悬滴培养系统，可用于长期培养、球状体形成、药物处理及后续分析。
细胞数量需要根据细胞类型和实验目的进行优化：
对于新的细胞类型，建议通过不同接种密度进行预实验，以确定最佳范围。
推荐每个悬滴使用 40 μL细胞悬液。
接种时建议缓慢移液，速度控制在 <50 μL/sec，以获得稳定的悬滴。接种前还应轻柔混匀细胞悬液，以保证细胞均匀分布。
SureDrop 是 Akura PLUS Hanging Drop Plate 中采用的微技术，可帮助实现悬滴的准确加液和吸液。
通过控制悬滴体积和细胞接种数量，可以获得较高一致性的球状体。同一块 96 孔板中，球状体直径的差异通常可控制在 5%以内。
接种时需要确保移液枪头与孔表面充分接触，以保证液体能够完整转移并形成均匀悬滴。
Akura PLUS 的弹簧结构可以在移液过程中自动调节接触状态，帮助保持稳定的密封和液体转移。
在转移球状体前，需要预先润湿 Akura 96 Plate，以减少转移过程中气泡产生。
通常向每个孔加入 40 μL Aggregation Medium进行预润湿，然后将液体完全吸除，仅允许底部残留少量液体。
首先将 Akura PLUS Plate 与 Akura 96 Plate 对齐，通过定位销和定位孔进行连接。
随后以较慢的移液速度（≤ 10 μL/sec）从 Akura PLUS 的入口加入 70 μL 培养基或缓冲液，即可将球状体转移到下方的 Akura 96 Plate 中。
悬滴属于低体积培养体系，特别是外圈孔容易出现蒸发。
严重蒸发可能导致培养基中的盐、血清等成分浓缩甚至析出，从而影响球状体形成和细胞状态，也可能改变长期实验过程中药物或其他处理物质的实际浓度。
建议：
Akura 96 Plate 每孔建议至少加入 50–70 μL培养基。
如果培养箱湿度控制存在问题，可以增加至至多约 80 μL，同时可以根据实验情况增加换液频率，例如每两天或每天换液。
对于长期培养且换液频率较低的实验，可以使用 InSphero Incubox，帮助改善湿度控制并降低培养板边缘孔的蒸发和边缘效应。
球状体无法形成可能与多种因素有关，包括：
因此需要根据具体细胞类型优化培养条件。
对于很多容易形成微组织的肿瘤细胞系，可以先使用 Akura 96 Plate进行测试。
对于原代细胞、复杂共培养体系，或者在超低吸附（ULA）板中也难以形成球状体的细胞系，则更推荐使用 Akura PLUS Hanging Drop System。
部分细胞可能还需要与成纤维细胞共培养，或者加入特定生长因子，才能形成致密球状体或维持器官型表型。
可以使用倒置明场显微镜观察球状体的形成、形态和生长情况。
建议使用长工作距离物镜（LWDO），优先选择 10×物镜。
如果需要观察全部 96 个孔，可以先将 Hanging Drop Plate 转移到一个空的无菌底板上进行成像。
成像完成后，再将其放回带加湿垫的底板中，然后重新放入培养箱继续培养。
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