一、引言

在肝脏疾病机制探索、药物代谢评估与再生医学研究领域，3D肝球模型因能复刻体内肝细胞的空间结构与细胞间交互作用，成为突破传统2D培养局限的关键工具。然而，科研人员常面临“肝球形成不均、功能维持短、操作流程复杂”等难题——从细胞复苏到球体培养，任何一个环节的细微偏差，都可能导致实验数据不可重复，甚至影响研究结论的可靠性。

LifeNet Health基于40多年人原代肝细胞研究经验，近期推出经验证合格可形成3D肝球细胞批次，及配套培养肝球实验方案，搭配培养基与耗材体系，将复杂的3D培养流程转化为“可复制、高稳定、长功能”的实验操作。让科研人员无需反复调试，即可获得形态均一、功能稳定的3D肝球，为肝脏研究提供更贴近体内生理状态的体外模型。

二、3步搞定3D肝球培养，告别繁琐调试

传统3D肝球培养的核心痛点，在于缺乏统一的操作规范——不同实验室的复苏温度、接种密度、换液频率差异，导致肝球大小不一、功能衰减速度不同。LifeNet Health的方案从“培养基制备-细胞复苏-接种培养-换液维护”全流程入手，通过控制每一个关键参数，确保肝球培养结果的一致性。

图1. 人原代肝细胞球体形成

1、培养基制备：预混配方

• 铺板培养基（HHPM）：需添加15 mL专用补充剂（HHPMS）至250 mL基础培养基，可按需加入青霉素/链霉素，经70%酒精消毒后在生物安全柜（BSC）内配制，避免污染；

• 维持培养基（HHCM）：500 mL基础培养基搭配5 mL补充剂（HHCMS），配制后经0.2 μm滤膜过滤灭菌，确保无微生物干扰；

• 复苏培养基（HHTM）：使用前需倒置混匀并过滤，37℃水浴预热20-30分钟，为细胞复苏提供合适的渗透压与温度环境。这种“预混补充剂+严格无菌操作”的操作设计，省去科研人员自行配比的繁琐，避免因成分浓度偏差导致的肝球功能异常。

2、细胞复苏与接种

人原代肝细胞对复苏过程较为敏感，温度骤变或剧烈操作易导致细胞破裂、细胞活力下降。复苏分为“分步控温”与“温和复苏”步骤：

• 冻存管转运：从液氮罐取出的冻存管，需先放入盛有液氮的便携容器中，避免运输过程中温度回升；

• 水浴解冻：37℃水浴中垂直放置冻存管，仅让细胞悬液部分浸入水中，90秒内完成解冻，且需倒置检查悬液流动性——若未完全液化，仅追加5秒水浴，避免过度解冻损伤细胞；

• 接种密度：推荐15,000 cells/mL或30,000 cells/mL两种密度，对应每孔1,500 cells或3,000 cells，可使用多通道移液器分注100μL细胞悬液，确保每孔细胞数量一致。按照该流程操作，LifeNet Health原代肝细胞的复苏存活率稳定在80%以上，并形成直径150-200 μm的均一肝球，无过大或过小球体，且球体边缘光滑、内部细胞紧密，符合3D肝球的理想形态。

3、培养与维护：半量换液，定期维护

3D肝球的长期培养，关键在于平衡营养供给与代谢废物清除。设计“半量换液”方案：

• 首次换液：接种后前5天静置培养，让细胞自然形成球体，避免早期换液破坏聚集状态。第5天用预热的完全HHCM更换50μL培养基（仅更换一半体积），避免剧烈操作打散球体；

• 后续维护：每两天（周一、三、五）半量换液一次，推荐成球培养时间为21天，确保肝球始终处于稳定的营养环境中。这种换液方式既能保证营养供给，又不干扰肝球结构，无需频繁监控，可节省实验时间投入。

图2. 肝球体形成的图像

A. 单个聚集体正在形成，但无法聚结为单个球体。

B. 聚集体正在形成，但边缘不光滑。类球体颜色较深。

C-D. 良好、致密、半透明的类球体，边缘清晰可辨。

三、配套产品支持，成球质量更有保障

优质3D肝球的形成，离不开适配的产品支撑。LifeNet Health为方案搭配“细胞+培养基+耗材”专属组合，相关组件经协同验证，避免因产品不兼容导致实验失败：

• 原代肝细胞：冻存细胞复苏活性高，具备出色的聚集成球能力，无需额外驯化即可直接使用；

• 全流程培养基：从复苏、铺板到维持，每款培养基均针对3D培养优化，含肝细胞所需的生长因子，助力肝球功能稳定；

• 使用耗材：推荐的低吸附U型底96孔板，能有效引导细胞聚集，减少贴壁干扰，保障肝球形态均一。

图3. 人原代肝细胞与原代肝细胞复苏培养基

四、适配多场景研究，解锁肝脏研究新可能

3D肝球成球模型，可应用于各类肝脏研究场景：

• 肝疾病机制研究：用疾病供体肝细胞构建3D肝球，复刻体内病理状态，助力解析NASH、肝纤维化等疾病发展过程；

• 药物代谢与毒性评估：可模拟药物长期暴露效应，评估药物代谢规律与潜在肝毒性；

• 毒理学：评估环境与食品污染物对肝脏的毒性。

五、总结

LifeNet Health凭借成熟经验，提供详细实验操作流程，并搭配“细胞+培养基+耗材”的配套产品，通过三步便捷培养流程，可保障肝球形态均一、功能稳定，能适配多种研究场景。该方案可帮助科研人员减少反复试错环节，将精力聚焦于核心研究，为肝脏疾病机制探索、药物代谢评估及再生医学研究提供有效可靠的模型支持，助力肝脏研究。

上海曼博生物医药科技有限公司是LifeNet Health的正式授权代理商，若需了解实验方案细节，可联系曼博生物技术团队，获取专属技术支持。

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