2025年8月3日，由中国生物物理学会、中国科学院生物物理研究所主办的第二十一次生物物理大会在四川省成都市世纪城国际会议中心圆满落幕。上海曼博生物团队深度参与本次大会，提供全方位的eProtein Discovery系统技术讲解与蛋白表达&纯化筛选解决方案，吸引了众多结构学专家老师，特别是膜蛋白研究者的驻足交流。

英国Nuclera公司的eProtein Discovery是一个无细胞蛋白质合成（CFPS）系统，也被称作体外转录/翻译系统，能够实现蛋白质的快速原型设计。该系统采用数字微流控卡盒和定制试剂，可同时自动筛选多达88种膜蛋白表达条件，包括在8种无细胞表达条件下对最多11种膜蛋白的筛选。在48小时内完成从DNA到膜蛋白的筛选与放大生产。

使用eProtein Discovery系统快速无细胞表达和纯化活性膜蛋白MsbA并验证其功能和结构

一、引言

膜蛋白对细胞功能十分重要，超过60%的FDA批准药物以膜蛋白为靶点，因此药物研发需要快速生产膜蛋白。传统的膜蛋白生产方法依靠去垢剂提取细胞膜，这往往会使蛋白质不稳定，导致蛋白质解折叠、聚集、非天然构象或失去活性。为满足下游应用需求而去除去垢剂的过程进一步增加了纯化难度，给结构和功能研究带来挑战。

eProtein Discovery系统通过整合无细胞蛋白质合成（CFPS）与自动化数字微流控筛选，与传统系统不同，无细胞蛋白质合成无需基于去垢剂的膜提取，可以直接优化纳米盘——纳米盘是一种脂质双层模拟物，由磷脂分子和膜支架蛋白组成，能为膜蛋白提供接近天然生物膜的脂质环境，从而维持其结构稳定和生物活性。可在24小时内完成11种DNA构建体和8组表达条件（无细胞混合体系）的筛选。这使得仅用48小时就能生产出正确折叠、有活性且适用于冷冻电镜分析的膜蛋白。

图1：eProtein Discovery系统膜蛋白生产工作流程

本文展示了eProtein Discovery技术如何实现MsbA的高产。MsbA是一种原核生物ABC转运蛋白，对革兰氏阴性菌中脂质A的转运及外膜完整性十分重要。它是膜结合的同源二聚体结构，具有六个跨膜螺旋，这导致其产量低、易错误折叠和聚集现象。通过优化纳米盘的组成，该技术在48小时内生产出具有功能的MsbA，并经ATP酶活性测定和冷冻电镜结构分析验证。

二、数据

1、MsbA纳米盘筛选产量高于去垢剂法

通过eProtein Discovery技术对不同组成的纳米盘进行筛选后发现，与去垢剂Brij-35相比，MsbA的产量明显提高，这凸显了类天然脂质双层环境对膜蛋白稳定性的优势（图2）。在8组表达条件中，含MSP1D1 dH5-DMPG的纳米盘纯化产量更高，与单独使用缓冲液相比，产量提升了5倍。

图2：利用纳米盘和去垢剂进行MsbA的表达与纯化。8组表达条件下MsbA产量对比

2、MsbA放大与浓缩

在确定MSP1D1 dH5-DMPG为更好纳米盘组成后，成功对 MsbA 进行了放大培养，获得了 120 μg/mL 的纯化蛋白（图 3A）。该产量与基于荧光的卡盒式产量预测结果高度吻合。此外，MsbA 被浓缩 15 倍至 1.8 mg/mL，且无明显聚集或沉淀现象。SDS-PAGE 结果证实了 MsbA 样品的纯度。

图3：MsbA的放大培养与浓缩。(A) 优化纳米盘条件下纯化的MsbA产量，与卡盒预测产量（蓝色）的对比。(B) 未浓缩MsbA的SDS-PAGE分析。

3、MsbA活性检测

采用磷酸盐释放测定法对其ATP酶活性进行了评估（图4）。结果证实，MsbA表现出预期的ATP酶活性，添加其底物脂质A后活性受到刺激。而ATP酶抑制剂原钒酸盐的存在明显降低了其活性，这进一步验证了纯化的MsbA蛋白的功能完整性。

图4：纯化MsbA的ATP酶活性。(A) 脂质A可刺激其活性，而钒酸盐则会抑制其活性。 (B) 3600秒时的ATP水解速率。

4、MsbA冷冻电镜分析

冷冻电镜分析纯化的MsbA-纳米盘复合物证实其结构与ABC转运蛋白一致，MsbA在纳米盘环境中呈现正确折叠的构象。与已发表的冷冻电镜重建结构的比对结果进一步证实，eProtein Discovery技术不仅能快速生产MsbA，还能保留其天然的结构动态特性。此外，多聚体组装分析显示，MsbA正确组装为二聚体构象——这是ABC转运蛋白发挥功能的关键前提。

图5：纳米盘中MsbA的冷冻电镜分析。(A) 纯化的MsbA在纳米盘中的冷冻电镜显微图显示出轮廓清晰的颗粒。(B) 二维分类图像，呈现MsbA的清晰特征。(C) 从头重建的三维模型，证实其正确折叠和二聚化状态。

三、结论

eProtein Discovery系统成功实现了在48小时内快速、高产生产出具有功能且结构完整的MsbA。与传统表达系统不同，这种无细胞方法无需依赖去垢剂提取膜成分，减少了蛋白质的不稳定性，同时保留了其天然折叠状态和活性。通过利用基于纳米盘的稳定化技术，该系统快速优化了表达条件，最终获得了折叠正确、适用于冷冻电镜分析的ABC转运蛋白。这些表明eProtein Discovery系统是一套具有变革意义的系统，能够加速膜蛋白的生产，对以难研究的膜蛋白为靶点的药物研发具有深远意义。

英国Nuclera公司由剑桥大学的博士生们于2013年创立。在撰写论文期间，他们发现蛋白质难以获取的问题是生物学领域的首要障碍和关键瓶颈。他们着手解决蛋白质难以获取的问题，以期改善人类健康状况。公司的愿景是打造出首个从DNA到蛋白质的原型设计系统，以减少在药物发现计划中获得靶蛋白的时间和障碍。

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