一、背景介绍

1月2日，药监局通过优先审评审批程序附条件批准了我国初个干细胞治疗药品艾米迈托赛注射液上市，用于治疗14岁以上患者在造血干细胞移植后出现的并发症。这标志着国内细胞治疗领域取得重要进展，增强了市场信心。同时，先博生物宣布其通用型异体CD19 CAR-NK药物SNC103在治疗复发和/或难治性大B细胞淋巴瘤的一期临床试验中取得积极结果，进一步推动了NK细胞疗法的发展。

自然杀伤（NK）细胞是免疫系统中的一类淋巴细胞，能够在不经过预先致敏的情况下靶向并摧毁肿瘤细胞和病原体。异体NK细胞治疗在免疫治疗，尤其是癌症治疗领域显示出较大潜力。然而，传统的扩增平台缺乏快速从早期工艺开发到商业化规模制造所需的适当的规模范围。横向扩展（scale-out）模型通常用于自体治疗，这使得批次间变异性增加，成本效益降低，并增加过程验证的复杂性，最终延误了细胞疗法的进展和患者接受治疗的时间。

PBS垂直轮生物反应器（PBS Biotech）通过支持60mL（PBS Mini 0.1L）至80L工作体积的细胞扩增解决了这一需求，使得多个工艺参数可以在小体积上测试、优化，并将其转化至更大规模的系统，最终实现治疗所需要的功能性NK细胞的高产量扩增。

二、材料与方法

2.1  小规模扩增

对两个供体的冷冻保存白细胞分离物进行解冻，并通过Ficoll梯度分离出外周血单个核细胞（PBMCs）。使用磁珠分离法去除CD3+细胞，随后富集CD56+细胞。

培养与扩增：将CD3-/CD56+ NK细胞种植在无饲养层细胞培养基中，补充人AB血清和细胞因子。在第7天，对细胞进行计数并重新种植到6M G-Rex烧瓶（Wilson Wolf Manufacturing）或PBS-0.5（至大工作体积为100mL G-Rex或500mL PBS）中。在第13天，使用离心法收集细胞，并使用控速冷冻仪冷冻在冷冻管中。

图1.对比PBS垂直轮生物反应器与G-Rex静态反应器中小规模供体来源的NK细胞扩增工作流程

2.2  PBS 3L中NK细胞扩增及模拟大规模（80L）扩增

通过保持细胞悬浮液与新鲜培养基的比例，使用3L垂直轮生物反应器（PBS-3）与已优化的G-Rex工艺进行比较。将3个供体的细胞种植在含有无饲养层细胞培养基的烧瓶中，并在第5天添加培养基。在第7天，对细胞进行计数并重新种植到6M G-Rex或PBS-0.5中。在第9天，对PBS-0.5中的细胞计数并将120mL细胞悬浮液重新种植到PBS-3中，加入1.88L细胞培养基。设定搅拌速率为30RPM，并在第11天添加新鲜培养基以达到3.0L至大体积。G-Rex扩增在第13天达到平台期并收获，PBS-3培养在第15天收获。对解冻后的细胞活性和细胞毒性进行评估。

图2.G-Rex与PBS中的培养工艺及后续模拟PBS-80L中NK细胞放大扩增的工作流程

其中，在Day9，对PBS 3L中的细胞进行计数，模拟将所有细胞从PBS 3L转移到PBS-80 (60L +培养基添加到80L)，培养至D15进行收获。

三、结果

3.1  搅拌速度对细胞产量和细胞毒性的影响

PBS垂直轮生物反应器在每个搅拌速度下均显示出优于G-Rex的累积倍数扩增（CFE）和EC:50（使用EC:50测定法，测量NK细胞在暴露于K562细胞时达到更大细胞毒性反应一半所需的细胞数量）。100RPM的搅拌速率下两个供体的扩增率更高，活性更强。增加搅拌速度与NK细胞扩增和改善细胞毒性反应相关（如下图3所示）。

图3. (A)与静态G-Rex培养相比，垂直轮生物反应器（20、50和100RPM实验组）在每个搅拌速度下都表现出优越的扩增倍数。

(B) 垂直轮生物反应器在所有搅拌速度下都表现出优于G-Rex的EC:50。搅拌率为100RPM时，两种供体扩增率高，效力强。

3.2  模拟大规模（80L）扩增

在PBS-3中扩增的NK细胞比G-Rex多出约1million个细胞/mL（图4A），CFE (累积扩增倍数)比G-Rex高1,750倍（CFE数据未显示）。解冻后的RCU测量显示，在2:1 E:T比例下，PBS-3与G-Rex的细胞毒性单位没有较大差异（数据未显示）。解冻后的NK细胞存活率在PBS-3与G-Rex中相当（数据未显示）。

图4. (A) 产量上垂直轮生物反应器（VW，0.1L，0.5L和3L数据统计）平均能达到360万个细胞/mL，而G-Rex平均能达到260万个细胞/mL。

(B)为PBS 3L中扩增收获的活细胞总数（pTVC）接种至垂直轮生物反应器中，为2.8E11个细胞，G-Rex为5E10个细胞。

为了比较垂直轮生物反应器与G-Rex在至大体积下预测的总细胞产量，基于6M G-Rex收获细胞的计数，计算了在第7天需要种植4个500M G-Rex（5L工作体积）。根据不同反应器中平均每毫升收获的细胞数，4个500M G-Rex总共能产生500亿个细胞，而PBS-80模拟预测在15天培养期后总共能产生2840亿个NK细胞。

图5.为了生产2840亿个NK细胞，G-Rex需要比Vertical-Wheel多2.5倍的培养基和一次性耗材成本和4倍的人员投入

四、讨论

需要进一步的探索来确定更高的NK细胞功能性和产量所需的更佳搅拌范围。然而，这里的初步数据展示了垂直轮作为NK细胞扩增平台相对于G-Rex的适用性和优势，G-Rex是免疫细胞类型常用的扩增选择。此外，常见平台如G-Rex和摇摆式细胞袋，在可扩展性方面有所限制，不利于异体细胞疗法过程。

正如PBS-80模拟所示，为了达到使用垂直轮生物反应器获得的2840亿个NK细胞，需要24个500M G-Rex。在G-Rex中扩增2840亿细胞估计需要2.5倍的培养基和一次性耗材成本，以及比垂直轮大规模扩增所需的人员多4倍。

五、结论

这项研究展示了垂直轮生物反应器在NK细胞扩增和规模化中的潜力。与传统的G-Rex相比，垂直轮生物反应器提供了更高的细胞产量和活性，同时降低了成本和人员需求。这为异体NK细胞治疗的发展提供了一个有前景的选择，有望加速从早期开发到商业化生产的进程。

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