Polysciences PEI 转染优化指南：293T/Expi293/CHO-S 瞬转效率与蛋白表达提升

摘要：本文详解PolysciencesPEI转染试剂在293T、Expi293F、CHO-S细胞中的优化方案，解决瞬转效率低、表达弱、产量低问题，提供标准化流程与问题排查。

关键词：PolysciencesPEI,PEI转染试剂,23966,24765,瞬时转染,转染效率,蛋白表达,抗体生产,HEK293T,Expi293F,CHO-S,转染优化指南

产品范围：Polysciences 25 kDa线性PEI（货号：23966系列）、PEIMAX（40kDa）（货号：24765系列）

适用场景：HEK293T、Expi293F、CHO-S细胞重组蛋白/单克隆抗体瞬时转染表达

PEI转染体系有哪些环节可优化？

聚乙烯亚胺（PEI）作为经典阳离子聚合物转染试剂，凭借成本可控、操作简便、易于放大等优势，已成为全球数千家实验室和生物制药企业进行重组蛋白/抗体瞬转的常用工具。然而，在实际应用中，用户常遇到转染效率低、蛋白表达弱、抗体产量上不去等问题。这些问题通常不是单一因素导致的，而是细胞状态、核酸质量、转染参数、培养条件等多因素协同作用的结果。

本文针对293T、Expi293F、CHO-S三种主流表达细胞系，基于Polysciences全球数千家用户的验证数据，系统梳理PEI转染体系的关键优化节点，提供可直接落地的标准化操作方案，并附上权威文献和工业界应用案例供参考。

一、核心影响因素及针对性优化方案

1.细胞状态优化（关键因素，占成功率的60%以上）

细胞质量是决定转染效率和后续蛋白表达的基础，任何转染试剂都无法弥补状态不佳的细胞带来的损失。

关键提示：

• 建议建立三级细胞种子库（主种子-工作种子-实验用细胞），每批次实验使用同一代次的细胞

• 悬浮细胞转染前18-24小时精准传代，确保转染时处于对数生长中期

• 避免使用刚复苏或长满后超过24小时的细胞进行转染

2.质粒DNA质量与用量优化

质粒DNA的纯度、内毒素含量和浓度直接影响PEI-DNA复合物的形成和细胞摄取效率。

（1）质量要求

· 纯度：A260/A280=1.8-1.9，A260/A230>2.0

· 内毒素含量：<1EU/μg（瞬转实验标准，使用去内毒素质粒提取试剂盒即可满足）

· 无污染物：无RNA、蛋白、酚、盐离子残留

· 浓度：500-1000ng/μL（浓度过低会导致稀释体积过大，影响复合物均一性）

（2）用量优化（按1×10⁶细胞计算）

关键提示：

· 多质粒共转染时，总DNA量保持不变，各质粒比例根据表达需求调整

· 抗体表达时，重链(HC):轻链(LC)质粒比例常用1:1、1:1.5、3:2，需根据具体抗体序列优化

· 避免使用过量DNA，否则会导致细胞毒性增加，反而降低蛋白产量

3.DNA:PEI比例（N/P比）优化

N/P比（PEI中氮原子与DNA中磷原子的摩尔比）是PEI转染体系中较核心的参数，直接决定复合物的净电荷、粒径大小、细胞摄取效率和细胞毒性。

优化方法：

· 采用矩阵法进行系统优化：固定DNA用量，测试PEI:DNA质量比从1:2到1:4的梯度

· 同时检测转染效率（如GFP阳性率）和细胞活力（转染后24-48小时）

· 选择转染效率高且细胞活力>80%的比例作为较优比例

关键提示：

· 不同批次的PEI工作液可能存在细微差异，建议每批次重新验证较优比例

· PEI MAX 40kDa的较优比例通常比25kDa线性PEI略低（约1:2.5-1:3）

4.转染复合物制备优化（操作细节决定成败）

复合物的制备方法直接影响其粒径分布和均一性，进而影响转染效率和重复性

（1）稀释液选择

· 推荐：Opti-MEM、无血清培养基，或PBS缓冲液、150mM NaCl溶液等作为稀释液

· 替代：无血清DMEM/F12培养基（不含抗生素、水解物）

· 避免：含有血清、抗生素、硫酸葡聚糖、高浓度磷酸盐或水解物的培养基（这些成分会与PEI竞争结合DNA，或导致复合物聚集，转染效率可下降50%以上）

（2）制备步骤（关键！顺序不能颠倒）

1. 将DNA和PEI分别用稀释液稀释至相同体积

2. 将稀释后的PEI溶液缓慢滴加到稀释后的DNA溶液中（勿颠倒顺序）

3. 轻轻涡旋5秒或用移液器吹打3-5次混匀

4. 室温孵育10-15分钟（共孵育时间不可超过20分钟，否则复合物会明显聚集变大）

5. 孵育完成后立即均匀加入细胞培养物中

（3）孵育体积

· 复合物孵育体积应为总培养体积的5%-10%

· 体积过小会导致局部浓度过高，复合物聚集；体积过大则复合效率下降

5.转染后培养条件优化

转染后的培养条件直接影响细胞的存活和蛋白的持续表达。

（1）温度优化

· 常规培养：37℃，5%CO₂，饱和湿度

· CHO-S细胞抗体表达：转染后24小时将温度降至31℃，可显著提高抗体产量（提升幅度30%-100%）

· 低温培养可降低细胞代谢速率，延长细胞存活时间，增加蛋白积累

（2）换液策略

· 293T贴壁细胞：通常情况下，将细胞培养板放入培养箱培养18~24小时后，更换含有正常浓度血清的培养基。

    ·如细胞可耐受无血清/低血清培养，也可无需更换培养基，PEI-DNA复合物不会对细胞造成毒性。

    ·如细胞在无血清/低血清条件下培养耐受较差，可在转染后4小时后更换含有正常血清的培养基。

· Expi293F悬浮细胞：如转染后24小时补加10%-20%体积的新鲜培养基或专用补料

· CHO-S悬浮细胞：如转染后不换液，转染后24小时和48小时分别补加专用补料

（3）收获时间优化

关键提示：

· 收获时间过早，蛋白表达未达到峰值；收获过晚，蛋白会被细胞分泌的蛋白酶降解；

· 建议进行时间梯度实验（每24小时取样一次），确定具体蛋白/抗体的较佳收获时间。

二、分细胞系标准优化流程

1.HEK293T贴壁细胞蛋白/抗体瞬转优化流程

1. 转染前1天：按每孔2×10⁵细胞的密度接种到6孔板中，37℃，5%CO₂培养

2. 转染当天：细胞汇合度达到70-80%，更换为2mL含低血清培养基（＜5%）

3. 复合物制备：

· A管：1μg质粒DNA+100μLOpti-MEM，轻轻混匀

· B管：3μL1mg/mLPEI+100μLOpti-MEM，轻轻混匀

· 将B管缓慢加入A管，轻轻涡旋5秒，室温孵育15分钟

4. 将复合物逐滴加入细胞孔中，轻轻晃动培养板使其均匀分布

5. 转染后18-24小时：更换为2mL新鲜完全培养基（含10%FBS）

· 如细胞可耐受无血清/低血清培养，也可无需更换培养基，PEI-DNA复合物不会对细胞造成毒性。

· 如细胞在无血清/低血清条件下培养耐受较差，可在转染后4小时后更换含有正常血清的培养基。

· 通常，在转染后24-48小时即可检测到表达的抗体/重组蛋白，转染后72-96小时可观察到较大产量，建议优化收样时间以较大化产量。

2.Expi293F悬浮细胞抗体瞬转优化流程（100mL摇瓶规模）

1. 转染前1天：按0.8×10⁶cells/mL的密度接种细胞，37℃，120rpm，5%CO₂培养

2. 转染当天：细胞密度达到1.8-2.2×10⁶cells/mL，活力≥98%

3. 复合物制备：

· A管：150μg质粒DNA（重链：轻链=1:1）+5mL Opti-MEM，轻轻混匀

· B管：450μL1mg/mL PEIMAX + 5mL Opti-MEM，轻轻混匀

· 将B管缓慢加入A管，轻轻涡旋5秒，室温孵育15分钟

4. 将复合物逐滴加入细胞培养物中，轻轻摇晃摇瓶混匀

5. 转染后24小时：补加10mL Expi293表达培养基和1mL ExpiFectamine293转染补料

6. 转染后96-120小时：收集上清，纯化抗体

3.CHO-S悬浮细胞抗体瞬转优化流程（100mL摇瓶规模）

1. 转染前1天：按1.0×10⁶cells/mL的密度接种细胞，37℃，120rpm，5%CO₂培养

2. 转染当天：细胞密度达到2.5-3.0×10⁶cells/mL，活力≥95%

3. 复合物制备：

· A管：200μg质粒DNA（重链：轻链=2:3）+ 5 mL Opti-MEM，轻轻混匀

· B管：500μL 1mg/mL PEIMAX + 5mL Opti-MEM，轻轻混匀

· 将B管缓慢加入A管，轻轻涡旋5秒，室温孵育15分钟

4. 将复合物逐滴加入细胞培养物中，轻轻摇晃摇瓶混匀

5. 转染后24小时：将温度降至31℃，补加10mLCHO表达培养基和0.25%DMA

6. 转染后48小时：再次补加10mL CHO表达培养基

7. 转染后120-168小时：收集上清，纯化抗体

三、常见问题排查表

四、参考文献与应用案例

· Stuible M, Burlacu A, Perret S, et al. Optimization of a high-cell-density polyethylenimine transfection method for rapid protein production in CHO-EBNA1 cells[J]. Journal of Biotechnology, 2018, 280: 33-41. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2018.06.307

· Overcoming the media design challenges in transient gene expression with CHO cell lines

· Porte M, Stock F, Horry H. Robust and reliable transient protein production with PEIpro®, a well characterized polyethylenimine optimized for transfection[J/OL]. GEN (Genetic Engineering & Biotechnology News), 2012, 32(5). 2012-03-01.

· Construction of a system for rapid evaluation of production enhancer gene in CHO antibody production

五、技术支持与联系方式

上海曼博生物医药科技有限公司是KyforaBio by Polysciences中国区官方独家供应商，提供全系列PEI转染试剂及专业技术支持（https://www.mine-bio.com/KyforaBiobyPolysciences/）,如果您在使用PolysciencesPEI转染试剂过程中遇到任何问题，请联系曼博生物的技术支持团队，曼博将为您提供一对一的技术指导，帮助您解决转染和表达过程中遇到的各种问题。

本文基于Polysciences公开资料由其中国提供商上海曼博生物整理，仅用于科研信息分享。上海曼博生物可提供Polysciences PEI转染试剂、PEIMAX、25kDa线性PEI、HEK293T瞬时转染、Expi293F抗体表达、CHO-S蛋白表达等相关产品与技术支持服务，助力重组蛋白、抗体及病毒载体研发与生产。