转导增强剂｜低MOI下如何提高T细胞慢病毒转导效率

一、慢病毒转导T细胞，难点不只是“能不能转”

CAR-T、TCR-T等基因修饰T细胞产品，多数依赖慢病毒载体把外源基因送进T细胞。慢病毒能转导处于静息状态的细胞，适用面较广；但在T细胞上，转导效率不仅取决于细胞是否增殖，还取决于激活状态。

实际工艺里，提高转导效率较直接的办法是加大病毒用量、提高MOI。但这会带来两个问题：一是慢病毒载体生产成本较高，提高MOI会直接推高物料消耗；二是单个细胞内的载体拷贝数（VCN）随之升高，而自失活型慢病毒倾向于整合到转录活跃的基因区域，VCN过高会增加基因毒性方面的顾虑，监管机构对ATMP产品的VCN也有相应的安全要求。

分化程度较低的naïve T细胞和干细胞样记忆T细胞，这类细胞与回输后在体内的存续和扩增能力相关，是工艺上希望保留的群体。在慢病毒体系中，更需要避免用高MOI去换取效率，那会把VCN一起推高。

现货型（off-the-shelf）异体T细胞治疗的发展，让脐带血来源的T细胞受到关注。脐带血T细胞表型更幼稚、增殖潜力较高、耗竭标记表达低，可提前冻存在脐带血库中。但如何在有效的基因修饰的同时，保住它原本的幼稚表型，是这类产品规模化生产需要解决的问题。

荷兰乌得勒支大学医学中心（UMC Utrecht）的团队在2021年发表的一项工作中，系统优化了脐带血CD8+ T细胞的慢病毒转导方案，转导效率达到83%左右，并评估了转导增强剂LentiBOOST在其中的作用。这项研究的数据，能够比较完整地回答一个问题：除了提高MOI，还有哪些环节能把转导效率做上去。

二、先把转导方案本身调到合适

在引入增强剂之前，研究团队先对转导方式、培养基和启动子做了比较。

（一）转导方式：过夜孵育优于离心转导

激活后第3天的脐带血CD8+ T细胞，在MOI为10的条件下，比较了离心转导（spinoculation，室温与病毒混合后32℃、800×g离心30分钟）和过夜孵育（14~16小时）两种方式。转导后第6天检测GFP阳性率：离心转导时PGK启动子为24%±5%、MND启动子为31%±9%；过夜孵育时PGK为48%±11%、MND为68%±8%，阳性率接近离心转导的两倍。

（二）培养基：无血清配方影响明显

转导当晚所用的培养基对结果影响同样明显。把过夜孵育的培养基从X-Vivo15换成StemMACS HSC Expansion Medium XF后，GFP阳性率进一步提高到PGK 78%±7.7%、MND 83%±8.8%。这是一套无血清转导体系，也更贴近后续GMP生产的方向。

（三）启动子：阳性率与表达强度是两件事

MND与PGK两种启动子在GFP阳性细胞比例上没有明显差别，但MND启动子驱动的蛋白表达更强，GFP阳性细胞的中位荧光强度（MFI）约为PGK的3倍，并且在按VCN归一化后差异依然存在。

表1 不同转导条件下的GFP阳性细胞比例（MOI 10）

（四）细胞来源：脐带血T细胞更易转，也更守得住幼稚表型

在同一套优化方案下，脐带血CD8+ T细胞比外周血CD8+ T细胞更容易被慢病毒转导。新鲜分离的脐带血T细胞是一群较均一的naïve细胞（CD45RO−CD62L+CD45RA+），外周血T细胞则是含有多个记忆亚群的混合群体。经过扩增和转导后，脐带血T细胞会重新回到naïve标记——CD45RO下调、CD45RA上调，外周血T细胞没有出现这一变化；同时，TIM3、LAG3等共抑制受体在脐带血T细胞上维持在较低水平。

这部分结果提示，转导效率的高低，是转导方式、培养基、启动子和细胞来源共同作用的结果，不宜只盯着MOI一个变量。

三、低MOI条件下，转导增强剂能带来多少增益

把上述方案固定为标准流程后，团队进一步测试了转导增强剂LentiBOOST（点击查看）。

（一）它是什么

LentiBOOST的活性成分是Poloxamer 338（又称Pluronic F108、Synperonic F108），属于非离子型、两亲性的A-B-A型三嵌段共聚物，由亲水的环氧乙烯链段和疏水的环氧丙烯链段组成。已知poloxamer类表面活性剂与脂膜作用时，可降低膜的微黏度、促进脂质交换、增强跨膜转运；LentiBOOST的活性成分正属于这一类，其增强作用发生在细胞膜层面——通过提高细胞膜对病毒颗粒的通透性、促进其跨膜转运来帮助病毒进入细胞，而不针对特定的病毒受体。

（二）转导效率：MOI越低，增益越明显

在MOI为10时，加入LB使GFP阳性T细胞比例增加约15%；在MOI为1时，增益扩大到约25%。GFP的表达强度（MFI）和qPCR测得的VCN也同步上升。这一作用并不局限于报告基因载体：在抗CD19的CAR载体（CAR19）上，MOI为1时转导效率从5.2%±2.5%提高到19.9%±5.9%；在WT1-TCR载体上同样能观察到。

表2. LentiBOOST在不同载体和MOI下对转导的影响

这种“低MOI增益更明显”的特点，恰好对应工艺上的实际需求：当病毒滴度有限、或希望压低MOI来控制VCN和成本时，增强剂提供的补偿空间更大。同类poloxamer增强剂在造血干细胞和小鼠T细胞上的效果此前已有报道，其GMP级配方也已经进入临床试验。

四、效率提高之后，细胞本身有没有受影响

使用增强剂时通常会有两个顾虑：会不会影响细胞存活和增殖，会不会改变转导后细胞的功能。研究对这两点都做了评估。

（一）活力与增殖

加入LB后，细胞活力仅有轻微下降，与不加LB的转导组之间没有统计学差异。增殖方面则需要区分情况：

• 单独用LB处理未转导细胞，对增殖没有影响；
• MOI为1转导的细胞，加入LB后增殖能力得以维持；
• MOI为10转导的细胞，加入LB后增殖、分裂和扩增指数出现下降趋势。

作者认为，这一下降与VCN升高在时间上吻合，更可能是高MOI下整合拷贝数增加带来的基因毒性应激，而不是LB分子本身的作用——因为MOI为1的细胞没有出现增殖下降。这一结果也从侧面提示，增强剂与较低MOI搭配，在效率和细胞状态之间更容易取得平衡。

（二）抗原识别、杀伤与细胞因子

为了确认LB是否影响T细胞的实际功能，团队用表达WT1特异性TCR的载体转导脐带血CD8+ T细胞，再做了一整套功能实验（图3）。

• 抗原识别：在MOI为1时，能识别WT1抗原肽四聚体的细胞比例从8.9%±2.3%提高到18.4%±2.2%；MOI为10时，从60.5%±10%提高到80%±7.3%，与转导效率的提高一致。
• 杀伤功能：在靶细胞与效应细胞比为1:1、与负载WT1肽的T2细胞共培养后，不加LB和加LB的WT1-TCR细胞分别杀死约81%和90%的靶细胞，而未转导细胞仅杀死约2%；在靶细胞更多、条件更苛刻的10:1比例下，加LB组的杀伤还略高一些。
• 细胞因子：两组转导细胞分泌的IFN-γ、TNF-α、颗粒酶A/B、穿孔素水平没有明显差异，均高于未转导细胞。

也就是说，LB带来的是“被转导细胞比例的增加”，而不是以牺牲单个细胞的识别、杀伤和分泌功能为代价。

五、放到工艺上，怎么用

从使用方式看，这类增强剂不需要改动已有的转导流程：与慢病毒同时加入细胞即可；离心转导可作为可选步骤。正式摸索时，建议设置0.1~5mg/mL的浓度梯度，找到各自体系开始起效的浓度。

对工艺开发而言，它的作用主要体现在以下方面：

• 在低MOI下补偿转导效率，减少病毒载体用量，进而降低物料成本；
• 帮助把单个细胞的VCN控制在合理区间，与ATMP产品的安全要求相衔接；

需要说明的是，这类增强剂并非只对T细胞有效。除原代T细胞外，CD34+造血干细胞等多种临床相关细胞类型中都有应用，对难转导的小鼠T细胞同样有效。具体到某个产品，合适的浓度、MOI搭配以及对细胞表型的影响，仍需要结合自身载体和细胞体系通过实验确定。

六、结语

回到开头的问题——在不提高MOI的前提下能否把转导效率做上去，这项研究给出的答案比较清晰：转导效率由转导方式、培养基、启动子、细胞来源和增强剂共同决定。把过夜孵育、无血清培养基和合适的启动子组合起来，脐带血CD8+ T细胞的转导效率可以达到83%左右；在此基础上，poloxamer类转导增强剂在低MOI下提供约25%的阳性率增益，且对细胞的活力、抗原识别和杀伤功能无明显影响。对于希望降低病毒消耗、控制VCN、同时保留低分化T细胞表型的工艺，这类工具可以纳入预实验的筛选范围。

参考文献