摘要

细胞的治疗已被证明是一种很有前途的创新疗法，用于治疗各种退行性疾病和自身免疫性疾病。当前全球范围内越来越多针对新适应证的干细胞药物进入临床试验阶段，特别是间充质干细胞（MSCs）不管是全球还是国内MSCs药物上市指日可待。然而大部分间充质干细胞还需制成冷冻制剂，以冷冻保存和储存细胞产品，为了保存自体或异体间充质干细胞用于未来的临床应用，需要一种可靠有效的冷冻保存方法。

制定一个成功的临床干细胞产品冷冻保存方案，冻存液、冷冻容器、冷冻温度、冷却和升温速率都是需要考虑的方面。本章重点介绍了美国BioLife Solutions关于MSCs冷冻保存的整体解决方案。

人间充质干细胞MSCs冻存

1、预冷CryoStor CS10 (BioLife Solutions公司冻存液产品)和Sexton CellSeal冻存管（BioLife Solutions子公司Sexton冻存管）保存在冰上或4°C待用。

2、对于每个供体MSC群体，将CellSeal冻存管上标有日期和供体姓名/ ID。

3、在收获后和计数完成的MSCs悬液在300g下离心5分钟，并去除培养基上清。

4、细胞颗粒以10-20 × 10⁶细胞/ml密度在的CryoStor CS10预冷冻存液中重悬，轻轻混合。最终制备成总细胞数在50x10⁶或100x10⁶个范围的MSCs 冻存溶液5ml细胞制剂冻存液待冷冻保存。

5、鲁尔接头冻存管手动灌装冻存液制剂：用16G针将5ml体积的细胞悬液吸进5ml注射器。抽吸细胞后，在注射器中抽吸一些额外的空气以用来将整个样品推入小瓶(图A&B)。

6、移液器接头冻存管手动灌装冻存液制剂：用酒精擦拭端口顶部(图4b)。将5ml细胞悬液通过带隔片的第一个孔逐渐注入CellSeal小瓶中。使用注射器中额外的空气排空管道(图C)。

7、该端口和第二个排气口使用Sexton手持式热合仪 (BioLife Solutions ，RF Sealing)密封，然后切割额外的管路(图D&E)。

图 Sexton CellSeal冻存管使用流程

8、将冻存管在冰上保存10分钟，使样品在冷冻过程开始前在冷冻保存溶液中达到平衡。

9、将冻存管放入Sexton 程序降温盒（BioLife Solutions，CellSeal Freezing Container）置于-80°C的冰箱中缓慢冷却，使冻存细胞样品在1°C/min下冷却至-80°C。样品以预定的冷却速率冷却到预定的末端温度(-80°C)。胞外冰核在-8-9℃左右发生在样品中。

10、当程序完成并达到所需温度时（至少4小时程序降温时间），将冻存管移出并转移到液氮罐中。

BioLife Solutions 冻存液

• 预配置即用型冻存液

• 无血清和不含蛋白质成分

• 减少产品中DMSO终浓度

• FDA备案DMF，全球IND案例500+，BLA案例10+

• BioLife中国区域曼博生物代理，供货价格和供货期稳定可靠

Sexton 冻存管

• 细胞治疗制剂药包材无菌冷冻冻存管
• 耐超低温，耐DMSO，抗断裂

• 具备微生物过滤口以及可热密封防止污染

• 取样端口设计可有助实现最大制剂回收率

• 加液填充端口可选注射器和移液器两种方式

• 可选择手动或自动(CT-5/AF-500)灌装方式

Sexton 梯度程序降温盒

• 程序降温功能

• 冷冻过程中无需醇类或等添加剂

• 简单化程序降温过程：放入-80℃冰箱4小时后转移样本即可

• 兼容性：兼容 2mI和 5ml 冻存管，12 支/次

• 降温速率:1C/min

冻存管热合仪选择

• 适用于EVA、PVC等材质

• 在ISO 13485和ISO 9001质量体系下进行管理

• 使用简单：无需预热，3秒热合，热合后无需剪切

• 热合面封口密封性佳，无残留

人间充质干细胞MSCs复苏

01- 在鲁尔接头冻存管中解冻冷冻保存的MSCs

1、从液氮罐中取出冻存管，将其转移到密封袋中，并将冻存管放在冰上直到开始解冻。

2、在水浴中或者无水干式复苏仪中快速解冻冷冻的间充质干细胞，直到所有冰晶融化。

3、将解冻后的细胞悬浮液转移到10ml离心管中，将细胞悬浮液缓慢稀释(滴入)到预冷的完全培养基中。

4、将细胞悬液在300 g下离心5分钟，并在1ml完全培养液中重组。用台盼蓝手工分析细胞活力或使用自动细胞计数器。

02-在移液枪接头冻存管中解冻冷冻保存的MSCs

1、从液氮罐中取出CellSeal冻存管。

2、确保这是正确的冻存管;核对捐赠者的姓名和身份。

3、将冻存管转移到密封袋中，并将小瓶放在冰上，直到开始解冻。

4、在水浴中或者无水干式复苏仪快速解冻冷冻的间充质干细胞，直到所有冰晶消失。

5、取下覆盖取针口底部针隔的箔片，在提取细胞之前，用酒精擦拭孔。

6、用5ml注射器和16G针头穿刺取物口，取出细胞

7、将细胞转移到10ml离心管中。

8、用核计数器测定细胞计数和细胞活力。

图 美国BioLife Solutions公司与曼博生物中国区合作的细胞冻存产品集合