Akron封闭系统｜IL-7、IL-15液体制剂的配方筛选与稳定性数据

一、背景

细胞因子为T细胞的完整活化提供T细胞受体（TCR）与共刺激信号之外的第三类信号。IL-2、IL-7、IL-15等同属γ链（γc）细胞因子，可作用于T细胞的生长与扩增。

Akron Bio（点击查看）自2006年起向细胞与基因治疗领域提供细胞因子、生长因子及人源血浆来源的培养基补充剂，相关产品应用于多个临床与商业化项目。

自体细胞治疗工艺中，细胞因子的单次用量通常较小，以往的处理方式是复溶大规格冻干品后再分装。随着细胞治疗生产向单元操作封闭化、工艺自动化与生产去中心化方向发展，试剂需要以低剂量、单次使用、即用型的形式交付，在操作速度与一致性之间取得平衡，同时满足无菌操作要求。

Akron Bio的Closed System Solutions（CSS）产品线（点击查看）用于在细胞与基因治疗工艺流程中闭合相关单元操作，覆盖人AB血清、人血清白蛋白（HSA）与重组人细胞因子，其中rHuIL-2的CSS剂型已上市。该类剂型的开发难点在于：细胞因子在液体形态、低浓度条件下容易发生聚集、表面吸附与氧化，剂型转换后需要维持其稳定性。

本文介绍CSS rHuIL-7与rHuIL-15的制剂开发工作，比较用于稳定小规格袋装细胞因子的三种制剂，给出rHuIL-15 CSS 12个月、rHuIL-7 CSS 9个月的理化稳定性评估结果，以及两种液体CSS剂型与传统冻干剂型在健康供者来源T细胞上的比较结果。

二、材料与方法

所有制剂均使用符合cGMP要求的化学品制备。重组人IL-7与IL-15的生产与纯化，采用Akron市售rHuIL-7与rHuIL-15冻干产品常规使用的、经过验证的工艺。rHuIL-7与IL-15 CSS产品灌装于Entegris Aramus 2D一次性袋组件中。

纯度通过RP-HPLC与SDS-PAGE评估。IL-7与IL-15的浓度由RP-HPLC测定，对未氧化的rHuIL-7或rHuIL-15色谱峰积分计算。

生物学活性测定中，rHuIL-7使用2E8细胞，rHuIL-15使用CTLL-2细胞。采用平行线浓度-反应模型，参照NIBSC参考标准估算相对效价，遵循USP<1032>《生物测定的设计与开发》与USP<1034>《生物测定的分析》所列原则。

三、制剂筛选与稳定性结果

（一）三种制剂的设计

为将IL-15配制为0.01mg/mL并评价初始稳定性，设计了三种制剂，组成如下：

表1 用于0.01mg/mL IL-15初始稳定性评价的三种制剂

两种去污剂的选择基于其理化性质，以及在理论上可减少聚集、降低蛋白对袋体的吸附、维持IL-15理化稳定性的预期。制剂II与制剂III中加入筛选出的抗氧化辅料，用于评价其抑制IL-15氧化的能力。

（二）制剂初筛结果

初筛以1个月为观察周期，在配制后即刻与1个月分别用RP-HPLC测定CSS袋中IL-15的浓度与纯度，并同步给出不含IL-15的稀释液、IL-15标准品、未经配制的IL-15原液及CSS制剂的色谱图，制剂I对应A至D、制剂II对应E至H、制剂III对应I至L。结果显示三种制剂出现分化：制剂I（中性缓冲配合去污剂1，未加抗氧化辅料）1个月后CSS袋浓度从约6.0降至约3.8 μg/mL，纯度从约87%降至约73%，色谱图出现额外峰；制剂II（酸性缓冲配合去污剂2并加入抗氧化辅料）1个月后浓度约9.0 μg/mL、纯度约83%；制剂III（中性缓冲配合去污剂2并加入抗氧化辅料）1个月后浓度约8.0 μg/mL、纯度约85%。去污剂1配合中性缓冲的组合未能维持IL-15在袋内的稳定，含去污剂2与抗氧化辅料的制剂II、III短期表现较好，据此进入长期稳定性研究。

（三）IL-15制剂II 12个月稳定性

将IL-15以制剂II配制为0.01mg/mL，按5mL灌装于20mL CSS袋，2-8℃储存，在12个月内跟踪理化属性：pH用电位法测定（A），浓度与纯度用RP-HPLC测定（C、D），各时间点做还原型SDS-PAGE（B）。结果显示，pH在6.3至6.5之间波动；SDS-PAGE纯度各时间点保持在90%以上，约95%至97%，9月未测，12月约96%；HPLC纯度从约85%缓慢下降至约65%；浓度在6.7至8.6 μg/mL之间波动，12月约6.8 μg/mL。整体看，制剂II在12个月内理化指标处于可接受范围。

（四）IL-15制剂III 12个月稳定性

将IL-15以制剂III配制为0.01mg/mL，按5mL灌装于20mL CSS袋，2-8℃储存，评估方法同前。结果显示，pH在7.3至7.5之间保持稳定；但降解在储存后期加快：SDS-PAGE纯度在前6个月约96%至98%，12月降至约76%；HPLC纯度从约89%降至约39%；浓度从约8.3 μg/mL持续降至约3.6 μg/mL。与制剂II相比，制剂III在12个月内的整体表现不如前者，对IL-15而言酸性缓冲的制剂II更适合。

（五）IL-7制剂II 9个月稳定性

将IL-7以制剂II配制为0.01mg/mL，按10mL灌装于20mL CSS袋，2-8℃储存，在9个月内跟踪理化属性：pH用电位法测定（A），浓度与纯度用RP-HPLC测定（C、D），各时间点做还原型SDS-PAGE（B）。结果显示，pH保持在约6.1；SDS-PAGE纯度约95%至96%；HPLC纯度约98%至99%；浓度在9个月时约7.4 μg/mL。制剂II在9个月内理化指标保持较好。

（六）IL-7制剂III 9个月稳定性

将IL-7以制剂III配制为0.01mg/mL，按10mL灌装于20mL CSS袋，2-8℃储存，评估方法同前。结果显示，pH保持在约7.2；SDS-PAGE纯度约93%至94%；HPLC纯度约96%至98%；浓度在9个月时降至约3.8 μg/mL。两种制剂的纯度指标均能保持，但制剂III在9个月时浓度下降较明显。

（七）生物学活性稳定性

在理化指标之外，进一步检测两种制剂的生物学活性随时间的变化：rHuIL-7与rHuIL-15分别以制剂II或制剂III配制为0.01mg/mL，IL-7按10mL、IL-15按5mL灌装于20mL CSS袋，IL-7考察9个月，IL-15考察12个月，误差线为各时间点测定结果的置信区间，结果如图7所示。IL-7两种制剂在9个月时每袋活性均保持在10 MIU以上；IL-15制剂II在12个月内每袋活性保持在约0.45至0.5 MIU，制剂III在9月一度降至约0.3 MIU、12月回到约0.4 MIU。相较之下，制剂II的活性保持更平稳。

（八）与冻干剂型的T细胞功能比较

为验证液体CSS剂型在实际使用中的表现，将其与冻干剂型在健康供者T细胞上比较。两名健康供者的冷冻单采血经复苏、分选、活化后，分别在培养基中补充复溶的IL-7与IL-15冻干粉，或CSS液体制剂；IL-7、IL-15终浓度分别为600、100 IU/mL，同时补充IL-2 100 IU/mL；配制好的培养基在2-8℃保存，于加入细胞因子后第12天使用。收获时评估CAR阳性细胞比例（A）与CD4+/CD8+比值（B）；收获细胞冷冻保存以模拟制剂储存，数日后复苏检测活率（C）。结果显示，两种剂型的CAR阳性率接近，冻干组约47%、液体组约45%；同一供者两种剂型的CD4+/CD8+亚群比例一致；冻存复苏后CD4+活率约97%至98%、CD8+活率约84%至88%，液体组与冻干组接近。即培养基在2-8℃放置12天后，CSS液体制剂对T细胞的支持表现与冻干剂型相当。

四、讨论

细胞因子驱动T细胞活化与扩增的机制已有较多研究，其在细胞治疗生产中的使用也较为普遍。将这些材料配制为适合生产应用的剂型与呈现形式，是行业关注的方向之一，在生产走向模块化、自动化以覆盖更多患者群体的背景下更为明显。

制剂开发结果表明，rHuIL-7与rHuIL-15可在低至10μg/mL的浓度下配制，并分别维持9个月（IL-7）与12个月（IL-15）的生物学活性，长期稳定性研究仍在进行中。

制剂开发工作围绕低浓度细胞因子的缓冲体系组成展开。低浓度条件可能加剧理化不稳定性并提高氧化风险，氧化是细胞因子已知的化学降解途径之一[1][2][3]。通过缓冲体系、去污剂与抗氧化辅料的组合，上述不稳定因素得到处理，从而建立可用于生产的、具有货架期的液体制剂。

参考文献