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全人源TCS肝毒评估核心看点

预测药物及化学物质诱导的肝毒性仍是一项重要挑战。药物研发过程中的基于动物的实验常无法识别此类风险，因其难以模拟非实质细胞在应对化合物干扰及疾病进展中的作用。传统的体外肝脏模型系统，例如原代人肝细胞单层培养，缺乏关键功能，或随着时间的推移，细胞结构和完整性会丧失。

本研究开发了一种全人源三培养体系（Tri-Culture System,TCS），分为24孔板和96孔板两种规格，由原代人肝细胞（Primary Human Hepatocytes, PHHs）与源自捐赠人体组织的内皮细胞和基质细胞组成。我们通过检测关键细胞间相互作用和连接极性标志物的定位、白蛋白和尿素的合成以及CYP酶的基础活性和诱导活性，在4周内评估了关键自组装细胞结构和功能的恢复和维持情况，从而确定了最合适的细胞密度和比例。对来自多位健康及患病供体的肝细胞进行单培养与三培养对比实验，结果显示：单培养体系中，白蛋白和尿素的基础合成速率、CYP酶基础活性及诱导活性均明显下降（白蛋白和尿素合成量下降超过50%，因细胞流失导致CYP基础表达水平检测不到）；而TCS中，上述细胞与生化指标在培养初期4-7天内升高，于7-10天达到稳态水平（白蛋白和尿素表达量维持在20%的范围内，CYP酶诱导倍数变化超过10倍）。这些结果直接与ZO-1和Cx32介导的细胞间相互作用和细胞连接促进的肝细胞重塑以及功能性胆小管的形成相对应。无论供体背景如何，非实质细胞的存在可在数周培养期内维持并增强肝细胞的完整性、极性及功能。综上，该全人源三培养体系为研究药物对健康及患病供体肝细胞功能的有效性与潜在毒性，提供了一种具有前景的新型分析工具。

一、全人源TCS体系：研究背景与目的

这项研究旨在开发并验证一种全人源肝细胞共培养模型系统，该系统可长期维持肝细胞的表型结构、肝脏基本功能及代谢能力，适用于病理学与毒理学研究。有研究表明，利用小鼠3T3成纤维细胞共培养可增强细胞完整性、对受体激动剂的应答能力及代谢功能（1-3）。然而，目前仍需要一种全人源且供体匹配的共培养体系，以模拟肝损伤及疾病进展过程中的细胞间事件。本研究描述了一种全人源肝细胞三培养体系（TCS），该系统实现了维持来自多个供体（代表不同正常和病变肝组织背景）的人类肝细胞批次的结构完整性和基本功能的初步目标。

二、全人源TCS体系：肝细胞培养与功能检测方法

1.肝细胞培养体系

• 单培养样本制备：将冻存原代人肝细胞（PHH）以150,000-250,000个细胞/cm²的密度（因细胞批次而异）接种于胶原包被的24孔板中，次日添加基质胶覆盖，构建三明治培养体系（Sandwich Culture,SC）。

• 全人源三培养体系（TCS）制备：在胶原包被的24孔板中接种饲养细胞，于37℃孵育30分钟后，加入冻存原代人肝细胞（PHH），接种密度为150,000-250,000个细胞/cm²（因细胞批次而异）。

2.处理与检测

• 形态学评估：在3-6周培养期内观察各培养模型的细胞形态。

• CYP酶诱导活性检测：培养1周后，分别用原型受体激动剂奥美拉唑（100µM）、CITCO（100nM）或利福平（25µM）处理三明治培养体系（SC）和三培养体系（TCS）中的肝细胞48小时，分别诱导CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4酶，采用P450-Glo检测试剂盒测定CYP酶活性。

• 白蛋白与尿素分泌检测：在培养24小时后，使用ELISA试剂盒，在特定时间点检测收集的培养基样本中的白蛋白和尿素分泌情况。

• 免疫荧光染色：评估原代人肝细胞（PHH）簇、饲养细胞、紧密连接及间隙连接的定位；采用5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（CDFDA）染色验证胆小管的形成及MRP-2转运蛋白的功能；使用抗体定位TCS中的牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）。

图.肝细胞培养的材料与方法

三、TCS体系：肝细胞长期培养及酶活性检测结果

图1.全人源三培养体系（TCS）示意图：左侧为自组装肝细胞簇的俯视图，右侧为肝细胞簇与混合滋养细胞层整合的侧视图。

图2.三培养体系（TCS）中肝细胞形态完整性（成簇能力）的维持。每张图像为同一视野，放大倍数：100倍。

图3.培养14天时三培养体系（TCS）中肝细胞极性及功能的恢复。A：白蛋白（ALB，红色）、CD31（绿色）、DAPI（蓝色）染色；B：功能性胆小管形成（CDFDA染色）；C：紧密连接染色（ZO-1）；D：缝隙连接染色（CX-32）；E、F：乙肝病毒（HBV）受体（NTCP）染色。放大倍数：A、B、E=100倍；C、D=200倍；F=400倍。

图4.3名不同供体的原代人肝细胞（PHH）以单批次或混合批次形式在三培养体系（TCS）中培养长达6周的代表性图像。放大倍数：100倍。

图5.在SC和TCS培养体系下，3个不同PHH批次在培养42天内的白蛋白分泌情况。

图6.3个不同批次的原代人肝细胞（PHH）在三明治培养体系（SC）和三培养体系（TCS）中培养35天内，利福平诱导的CYP3A4酶活性变化。

图7.培养第7天，三明治培养体系（SC）与三培养体系（TCS）中CYP酶（CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4）诱导活性对比。

四、TCS体系肝细胞培养研究结论与展望

• 全人源三培养体系（TCS）模拟了关键肝细胞成分及多细胞相互作用，可延长并维持原代人肝细胞（PHH）培养体系的长期存活能力、功能完整性及代谢能力。

• 该体系支持化合物及其代谢产物（如活性代谢产物和结合物）的长期暴露或重复暴露实验。

• TSC适用于代谢谱分析、低代谢化合物清除率检测、酶诱导实验及肝毒性风险评估。

• 拓展了供体来源范围，可纳入来自多数健康及患病组织（如非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、乙肝相关肝组织）的原代人肝细胞（PHH）批次。

参考文献

1. Khetani SR and Bhatia SN (2008) Microscale culture of human liver cells for drug development. Nat Biotechno/26: 120-126.

2. Ukairo 0 et al. (2013) Long -term stabiity of primary rat hepatocytes in micropatterned cocultures. J Biochem Mol Toxico/27: 204-212.

3. Ukairo O et a. (2013) Bioactivation and toxicity of acetaminophen in a rat hepatocyte micropatemed coculure system. J Biochem Mol Toxico/27: 471-478

拓展阅读

1. 全人源细胞三培养体系｜形态、存活时长及功能特性表征

2. 全人源肝细胞三培养体系｜CYP450基因诱导潜能表征

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