摘要

MSC-EV 临床应用进程加快，但规模化生产放大是行业共性痛点。本研究基于无动物源 MSC 及配套培养基体系，采用微载体 - 搅拌罐生物反应器工艺，在 250mL 规模完成关键工艺参数优化后，于 15L 规模实现稳定放大。放大后 EV 产量、粒径分布、特征标志物及生物功能均与小试高度一致，为 MSC-EV 工业化生产与临床申报提供可行的工艺参考。

关键词

外泌体细胞外囊泡（EV）MSC-EV规模化生产搅拌罐生物反应器微载体关键工艺参数（CPP）关键质量属性（CQA）RoosterBio

MSC-EV规模化生产新范式：从250mL到15L稳健放大——EV产量稳定

2023 ISEV年会上，RoosterBio与Sartorius Stedim North America联合发布了学术海报《Successful development of a scalable and robust process for MSC-EV production》，系统展示了基于微载体-搅拌罐生物反应器的hMSC-EV生产工艺：在250mL规模完成关键工艺参数（CPP）优化后，成功在15L（Biostat STR）规模实现稳健放大，且关键质量属性（CQA）与小试结果保持高度一致。

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为间充质干细胞（MSC）旁分泌功能的重要载体，正加速从基础研究走向临床应用。然而，当"产量"成为临床级产品的基本要求时，如何以较优的细胞来源与收集培养基，将EV生产工艺稳定放大至规模化制造水平，成为行业共同面对的主要挑战。本海报正是对这一问题的直接回应。

一、背景：临床转化提速，MSC-EV规模化生产亟待破局

EV是纳米级的脂质双层颗粒，由多种类型细胞释放，内部携带蛋白质、核酸（RNA和DNA）与脂质等生物货物；其中，由间充质基质/干细胞（Mesenchymal Stromal/Stem Cells）释放的hMSC-EV，正快速进入临床试验阶段。

但EV生产面临一个瓶颈：如何利用较优的细胞来源与收集培养基，实现生产过程的规模化放大（scaling up）。这正是RoosterBio的切入点——可规模化的高质量无动物源（xeno-free, XF）hMSC及其MSC-EV生产用培养基体系，为规模化工艺开发奠定了物料基础。

二、研究设计：250mL小试开发+15L放大验证，双轨并行

2.1 主要物料：细胞、扩增培养基与EV收集培养基

本次研究采用RoosterBio（点击查看）完整的产品组合：以无动物源人骨髓MSC（Rooster Vial-hBM）作为细胞来源，在Rooster Nourish扩增培养基中于Ambr 250（Sartorius）系统进行细胞扩增；进入EV分泌阶段后，更换为低颗粒EV收集培养基Rooster Collect-EV进行EV收集。整个流程在搅拌罐生物反应器体系中完成。

2.2 开发与验证策略：CPP优化先行，大罐验证跟进

研究采用"小规模开发、大规模验证"的两步策略。在250mL系统中评估并优化关键工艺参数（Critical Process Parameters, CPPs），包括：微载体类型、MSC扩增时长、微载体密度、初始细胞接种密度与EV收集时间；随后，将小规模确定的CPPs在15L生物反应器中加以验证。与此同时，研究对关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQAs）进行系统评估，覆盖颗粒数量与粒径、EV Marker（Western blot检测四跨膜蛋白、脂质化颗粒比例）以及生物效价。

三、结果：参数可定、放大可行、质量可比

3.1 小规模CPP优化：确定工艺窗口

在250mL系统中，研究团队对各项CPP进行了系统考察：

微载体筛选：Synthemax II微载体展现出约80%的MSC贴壁率；
MSC扩增时长：MSC生长在第5天达到峰值后趋于稳定，据此将5天确定为生长阶段时长；
微载体密度：微载体密度为3X，可提高细胞产量；
接种密度：1X细胞接种密度即可达到较高细胞产量，且不会引起细胞/微载体聚集；
收集时长：更换为EV收集培养基后，颗粒产量持续上升，并在收集阶段第5天达到峰值。

采用优化后CPPs的工艺，在收获日可稳定获得可比的细胞数量与1–1.5×10¹⁰颗粒/mL的EV产量；供者间（Donor 1/Donor 2）与批次间（N=3批次，vessel-to-vessel）均表现出良好的重复性。

参数	优化结果
微载体类型	Synthemax II（Corning）
微载体密度	3X
细胞接种密度	1X
MSC生长时长	5天
EV收集培养基	Rooster Collect-EV
EV收集时长	5天

表1：250mL开发优化的部分关键工艺参数

3.2 15L放大验证：结果与250mL高度一致

在15L生物反应器中，工艺流程为：种子扩增4天→生长阶段5天→收集阶段5天。以1X接种密度与3X微载体密度运行，细胞生长阶段结束后更换为收集培养基。

放大结果显示：15L罐内MSC在生长阶段末（第5天）达到约4E5 cells/mL，与250mL结果相当；EV收集阶段第5天，颗粒产量达到约1.7×10¹⁰颗粒/mL，同样与250mL数据一致。两个体系在细胞生长与颗粒收集两个维度上的结果均具可比性，有力证明了工艺的可放大性。

3.3 CQA可比性：EV身份与生物效力全面达标

在质量层面，海报通过多种正交分析方法对收获物进行了系统表征：

颗粒计数与完整性：纳米颗粒追踪分析（NTA）和荧光膜染色结果显示，在检测到的所有纳米颗粒中，约91%的颗粒对脂质膜染料Memglow呈阳性染色，提示约91%的颗粒为膜结构完整的EV；

粒径分布：粒径分布在不同规模（250mL与15L）及不同收集时长之间保持一致；

EV标志物：收获的条件培养基中检出经典EV标志物——四跨膜蛋白CD63、CD9、CD81，以及膜内标志物TSG101，两种培养规模差异不大；
生物效力：15L Biostat STR收获的EV条件培养基在体外划痕愈合实验中，伤口闭合效果优于未条件化培养基（阴性对照），并与生长培养基（阳性对照）相当；

多方法交叉验证：颗粒在三种独立分析方法中证实为典型的脂质双分子层囊泡结构。

四、结论与启示：可放大、稳健的MSC-EV工艺

4.1 研究结论

本研究成功开发了一套可重复、可放大的微载体-搅拌罐hMSC-EV生产工艺：以RoosterBio无动物源hMSC（Rooster Vial-hBM）为种子细胞，配合Rooster Nourish扩增培养基与Rooster Collect-EV低颗粒收集培养基，在250mL规模完成工艺开发，并在15L规模成功放大验证。工艺可稳定产出外泌体颗粒，结构完整，表达CD81、CD63、CD9等EV特异性四跨膜蛋白标志物，并在体外划痕愈合实验中展现出生物功能活性。

4.2 下一步计划与启示

对MSC-EV药物开发者而言，该研究传递了一个明确信号：通过"高质量细胞库+专用扩增/收集培养基+微载体搅拌罐工艺"的组合，EV上游生产已经具备可工程化、可规模化的实现路径；而上游工艺的稳健性与可放大性，正是后续下游纯化、质量表征与临床申报的可靠起点。

产品名称	在本工艺中的作用
Rooster Vial-hBM	无动物源人骨髓MSC（xeno-free hBM MSC），作为EV生产细胞来源
Rooster Nourish	MSC扩增培养基，用于250mL及15L间充质干细胞扩增
Rooster Collect-EV	低颗粒EV收集培养基，用于EV收集阶段

表2：本研究使用的RoosterBio产品

关于 RoosterBio

RoosterBio成立于2013年，总部位于美国马里兰州，是全球MSC生物制造领域的知名企业。公司专注于提供高度工程化的hMSC细胞库、生物工艺培养基及外泌体生产解决方案，致力于从根本上简化间充质干细胞和外泌体的规模化生产工艺。

Rooster培养基组合解决方案，是覆盖MSC上游扩增、EV高产量收集、3D规模化放大、临床转化申报的一体化完整体系。RoosterBio以全流程工艺思维解决细胞与外泌体生产中的效率、纯度、放大、合规四大痛点，无论处于基础研究、工艺开发还是新药申报阶段，均可提供标准化、可落地、可产业化的完整培养方案，为国内细胞外囊泡产业标准化发展提供稳定可靠的原料支撑。

产品线：——骨髓/脂肪/脐带hMSC细胞库、Rooster Nourish免换液扩增培养基、Rooster Collect-EV外泌体收集培养基、Rooster HD-EV扩增收集一体化培养基
产品等级：——RUO/cGMP级双轨并行
法规支持：——FDA II主文件（Master File）、国际监管支持档案，支持申报时交叉引用

上海曼博生物（MineBio）是RoosterBio在中国区域的官方合作伙伴，可为国内研究者提供RoosterBio全线产品的进口、技术支持和本地化服务（点击查看），了解更多产品信息或获取技术文档，欢迎联系曼博生物。